ヒト細胞株活性化試験（h-CLAT）におけるタンパク質アレルゲン性に対するリポ多糖類の寄与を排除する

Eliminating the contribution of lipopolysaccharide to protein allergenicity in the human cell-line activation test (h-CLAT).

• Hanae Kobayashi-Tsukumo
• Kanami Oiji
• Dan Xie
• Yuka Sawada
• Kunihiko Yamashita
• Shinichi Ogata
• Hajime Kojima
• Hiroshi Itagaki

抄録

我々は以前、ヒト細胞株活性化試験（h-CLAT）のマーカーと基準に基づいて、天然由来のタンパク質による皮膚感作を検出する試験法を開発し、h-CLATがタンパク質のアレルゲン性を評価するのに有用であることを示した。しかし、試験蛋白質には様々な量のリポ多糖類（LPS）が混入しており、これがCD86やCD54の発現刺激に寄与している可能性があった。本研究では、天然由来のタンパク質による皮膚感作性の評価において、LPSの影響を排除する方法を開発した。LPSによるCD54発現の増加を緩和することができるカスパーゼ1阻害剤アセチル-Tyr-Val-Ala-Asp-クロロメチルケトン（Ac-YVAD-cmk、以下YVADと略す）と、その脂質部位（すなわちLPSの毒性成分）に結合することでLPSの影響を抑制するポリミキシンB（PMB）の2種類の阻害剤を用いて試験を行った。24時間曝露後、YVADおよびPMBは、LPS誘発CD86およびCD54発現を減少させた。特に、PMBの効果は、事前インキュベーション時間および温度に依存し、最も強力な効果は37℃で24時間の事前インキュベーション後に観察された。また、唯一の37℃で24時間の細胞培養培地（CCM）との事前インキュベーションは、この結果は、おそらくLPSに結合するCCMの成分に起因すると、PMBのそれと同様の抑制効果を示した。また、オバルブミン（1070EU/mg LPS）及びオボムコイド、リゾチーム（それぞれ2.82及び0.234EU/mg LPS）の存在下でも同様の効果が認められた。これらの結果から、PMBおよびCCMは、タンパク質のアレルゲン性を評価する際のLPSの影響を効果的に排除し、皮膚感作を誘発するタンパク質の可能性をより正確に評価できることが示された。

We previously developed a test for detecting naturally occurring protein-induced skin sensitization based on the markers and criteria of the human cell-line activation test (h-CLAT) and showed that the h-CLAT was useful for assessing the allergenic potency of proteins. However, test proteins were contaminated with varying amounts of lipopolysaccharide (LPS), which might have contributed to the stimulation of CD86 and CD54 expression. In this study, we developed a method to exclude the effects of LPS in the assessment of skin sensitization by naturally occurring proteins. We tested two inhibitors [the caspase-1 inhibitor acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp-chloromethylketone (Ac-YVAD-cmk; hereafter referred to as YVAD), which can mitigate the LPS-induced increases in CD54 expression, and polymyxin B (PMB), which suppresses the effect of LPS by binding to its lipid moiety (i.e., the toxic component of LPS)]. After a 24 hr exposure, YVAD and PMB reduced LPS-induced CD86 and CD54 expression. In particular, the effect of PMB was dependent upon pre-incubation time and temperature, with the most potent effect observed following pre-incubation at 37°C for 24 hr. Moreover, only pre-incubation with cell-culture medium (CCM) at 37°C for 24 hr showed an inhibitory effect similar to that of PMB, with this result possibly caused by components of CCM binding to LPS. Similar effects were observed in the presence of ovalbumin (with 1070 EU/mg LPS) and ovomucoid, and lysozyme (with 2.82 and 0.234 EU/mg LPS, respectively) in CCM. These results indicated that PMB and CCM effectively eliminated the effects of LPS during assessment of protein allergenicity, thereby allowing a more accurate evaluation of the potential of proteins to induce skin sensitization.