神経集中治療におけるマイクロダイアリシスと近接拡張アッセイ技術を用いたヒト外傷性脳損傷における炎症のタンパク質バイオマーカーのモニタリング

Monitoring of Protein Biomarkers of Inflammation in Human Traumatic Brain Injury Using Microdialysis and Proximity Extension Assay Technology in Neurointensive Care.

• Philip Dyhrfort
• Qiujin Shen
• Fredrik Clausen
• Måns Thulin
• Per Enblad
• Masood Kamali-Moghaddam
• Anders Lewén
• Lars Hillered

抄録

外傷性脳損傷（TBI）には、神経炎症が強く関与する二次的な損傷メカニズムが存在する。ヒトTBIにおける複雑な炎症性カスケードをモニターするために、我々は、脳微小透析（MD）および多重近接拡張アッセイ（PEA）技術を使用し、神経集中治療下にある重度のTBI患者10人のMDサンプルにおける炎症の92のタンパク質バイオマーカーのレベルを5日間、3時間ごとに同時に測定した。1μLのMDサンプルを、各タンパク質に結合するペアオリゴヌクレオチド共役抗体でインキュベートし、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応による定量化を可能にした。統計解析に適したタンパク質は69個であった。早期（<48h；例：CCL20、IL6、LIF、CCL3）、中期（48-96h；例：CCL19、CXCL5、CXCL3）、中期（48-96h）の5つの異なるパターンを発見した。CCL19、CXCL5、CXCL10、MMP1）、後期（96時間以上；CD40、MCP2、MCP3）、二相性のピーク（CXCL1、CXCL5、IL8）、または安定したピーク（CCL4、DNER、VEGFA）／低傾向のいずれかであった。高タンパク質レベルは、例えば、CXCL1、CXCL10、MCP1、MCP2、IL8について観察され、一方で、例えば、CCL28およびMCP4は、低レベルで検出された。また、これまでヒトTBIでは研究されていなかったいくつかのタンパク質（CCL8、-19、-20、-23、CXCL1、-5、-6、-9、-11、CST5、DNER、Flt3L、SIRT2）が検出されました。相互相関解析により、LIFとCXCL5が炎症性カスケードにおいて中心的な役割を果たしている可能性があることが明らかになりました。本研究は、TBI患者における潜在的な炎症性バイオマーカーの個々の時間的傾向を示すユニークなデータセットを提供するものである。我々は、MDとPEAの組み合わせは、損傷を受けたヒトの脳における複雑な炎症性カスケードをマッピングするための強力なツールであると結論付けている。この技術は、複雑な二次損傷経路のタンパク質プロファイリングに新たな可能性を提供するものである。

Traumatic brain injury (TBI) is followed by secondary injury mechanisms strongly involving neuroinflammation. To monitor the complex inflammatory cascade in human TBI, we used cerebral microdialysis (MD) and multiplex proximity extension assay (PEA) technology and simultaneously measured levels of 92 protein biomarkers of inflammation in MD samples every three hours for five days in 10 patients with severe TBI under neurointensive care. One μL MD samples were incubated with paired oligonucleotide-conjugated antibodies binding to each protein, allowing quantification by real-time quantitative polymerase chain reaction. Sixty-nine proteins were suitable for statistical analysis. We found five different patterns with either early (<48 h; e.g., CCL20, IL6, LIF, CCL3), mid (48-96 h; e.g., CCL19, CXCL5, CXCL10, MMP1), late (>96 h; e.g., CD40, MCP2, MCP3), biphasic peaks (e.g., CXCL1, CXCL5, IL8) or stable (e.g., CCL4, DNER, VEGFA)/low trends. High protein levels were observed for e.g., CXCL1, CXCL10, MCP1, MCP2, IL8, while e.g., CCL28 and MCP4 were detected at low levels. Several proteins (CCL8, -19, -20, -23, CXCL1, -5, -6, -9, -11, CST5, DNER, Flt3L, and SIRT2) have not been studied previously in human TBI. Cross-correlation analysis revealed that LIF and CXCL5 may play a central role in the inflammatory cascade. This study provides a unique data set with individual temporal trends for potential inflammatory biomarkers in patients with TBI. We conclude that the combination of MD and PEA is a powerful tool to map the complex inflammatory cascade in the injured human brain. The technique offers new possibilities of protein profiling of complex secondary injury pathways.