CHO 細胞で産生された組換えタンパク質のタンパク質分解に関与する C1s プロテアーゼの同定と CRISPR/Cas9 の不活性化

Identification and CRISPR/Cas9 Inactivation of the C1s Protease Responsible for Proteolysis of Recombinant Proteins Produced in CHO Cells.

• Sophia W Li
• Bin Yu
• Gabriel Byrne
• Meredith Wright
• Sara O'Rourke
• Kathryn Mesa
• Phillip W Berman

抄録

チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞における組換えタンパク質の発現に伴うプロテオライシスは、HIVワクチンを含む生物製剤の開発を妨げてきた。CHO細胞で発現すると、組換えHIVエンベロープタンパク質、gp120は、中和抗体によって認識される重要なエピトープでセリンプロテアーゼによるタンパク質分解クリッピングを受けます。この問題は、米国やヨーロッパを含む先進国の多くで流通している主要な遺伝子サブタイプを代表するクラッドBウイルスのエンベロープ蛋白質にとって特に深刻である。本論文では、CHO細胞におけるgp120のタンパク質分解に関与するプロテアーゼとして、補体カスケードに由来するセリンプロテアーゼである補体コンポーネント1's（C1s）を同定した。CHO細胞株におけるC1sプロテアーゼのCRISPR/Cas9ノックアウトは、組換え的に発現したgp120に対するタンパク質分解活性を除去することが示された。さらに、Ｃ１ｓプロテアーゼおよびＭＧＡＴ１グリコシルトランスフェラーゼをノックアウトしたＣ１ｓ ＭＧＡＴ１ ＣＨＯ細胞株は、クレードＢ単離物（ＢａＬ-ｒｇｐ１２０）からのアンクリップドｇｐ１２０の産生を可能にし、複数の広義中和モノクローナル抗体（ｂＮ-ｍＡｂｓ）の結合に必要とされるｇｐ１２０上のマンノース-５糖鎖を濃縮した。この技術が利用できるようになることで、世界のクレードBウイルスが流通している地域で、複数のワクチンコンセプトをスケールアップして試験することが可能になります。さらに、Ｃ１ｓプロテアーゼによって引き起こされるタンパク質分解の問題は、Ｃ１ｓ欠損ＣＨＯ細胞株を用いて、ＣＨＯ細胞においてセリンプロテアーゼ活性に感受性のある他の組換えタンパク質を発現させるためのより広範な必要性を示唆している。同様に、CHO細胞株におけるC1sを同定し、ノックアウトするためにここに記載されているワークフローは、他のCHOプロテアーゼによる生物学的製剤のプロテオリシスを改善するために適用することができます。

Proteolysis associated with recombinant protein expression in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells has hindered the development of biologics including HIV vaccines. When expressed in CHO cells, the recombinant HIV envelope protein, gp120, undergoes proteolytic clipping by a serine protease at a key epitope recognized by neutralizing antibodies. The problem is particularly acute for envelope proteins from clade B viruses that represent the major genetic subtype circulating in much of the developed world, including the US and Europe. In this paper, we have identified complement Component 1's (C1s), a serine protease from the complement cascade, as the protease responsible for the proteolysis of gp120 in CHO cells. CRISPR/Cas9 knockout of the C1s protease in a CHO cell line was shown to eliminate the proteolytic activity against the recombinantly expressed gp120. In addition, the C1s MGAT1 CHO cell line, with the C1s protease and the MGAT1 glycosyltransferase knocked out, enabled the production of unclipped gp120 from a clade B isolate (BaL-rgp120) and enriched for mannose-5 glycans on gp120 that are required for the binding of multiple broadly neutralizing monoclonal antibodies (bN-mAbs). The availability of this technology will allow for the scale-up and testing of multiple vaccine concepts in regions of the world where clade B viruses are in circulation. Furthermore, the proteolysis issues caused by the C1s protease suggests a broader need for a C1s-deficient CHO cell line to express other recombinant proteins that are susceptible to serine protease activity in CHO cells. Similarly, the workflow described here to identify and knockout C1s in a CHO cell line can be applied to remedy the proteolysis of biologics by other CHO proteases.

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