凍結乾燥マウス精子の室温保存におけるトレハロースの効果

Effect of trehalose on the preservation of freeze-dried mice spermatozoa at room temperature.

• Daiyu Ito
• Sayaka Wakayama
• Yuko Kamada
• Ikue Shibasaki
• Satoshi Kamimura
• Masatoshi Ooga
• Teruhiko Wakayama

抄録

精子の凍結乾燥は、液体窒素や深い冷凍庫を使用せずに哺乳類の遺伝物質を保存するための便利で安全な方法である。しかし、凍結乾燥精子（FD精子）は、細胞質内精子注入（ICSI）後の子孫の成功率が低いため、頻繁には使用されていない。本研究では、異なるマウス系統のFD精子を室温（RT）で保存するための保護剤としてトレハロースの最適濃度と作用点を決定した。トレハロースはＩＣＲマウスのＦＤ精子を凍結乾燥手順そのものから保護する可能性を示さなかったが、ＦＤ精子を室温（ＲＴ）で１ヶ月以上保存した場合、胚盤胞率は有意に改善された（トレハロースなしでは５６〜６３％対２９％）。また、トレハロースの最適濃度は0.5Mであった。重要なことは、近交系マウス系統（C57BL/6N、C3H/He、129/Sv）の精子を用いた場合に顕著な結果が得られ、RTで3ヶ月保存したFD精子を用いた場合には多くの子孫が得られたことである（トレハロースなしの6〜11％に対して26〜28％）。しかし、ＦＤ精子のＤＮＡ損傷をγ-Ｈ２Ａｘアッセイで調べたところ、トレハロースはＦＤ精子をＤＮＡ損傷から保護することができなかった。これらの結果から、トレハロースは、RTでの長期保存中に精子DNAではなく他の精子因子を保護する可能性があり、トレハロースは近交マウス系統に対してより効果的であることが示唆された。

Freeze-drying of spermatozoa is a convenient and safe method to preserve mammalian genetic material without the use of liquid nitrogen or a deep freezer. However, freeze-dried spermatozoa (FD sperm) are not frequently used because of the low success rate of offspring after intracytoplasmic spermatozoa injection (ICSI). In this study, we determined the optimal concentration and a point of action of trehalose as a protectant for the preservation of FD sperm from different mouse strains at room temperature (RT). Although trehalose demonstrated no potential to protect the FD sperm of ICR mice against the freeze-drying procedure itself, the blastocyst rate was significantly improved when FD sperm was preserved for more than 1 month at RT (56-63% vs. 29% without trehalose). The optimal concentration of trehalose was 0.5 M. Importantly, remarkable results were obtained when spermatozoa of inbred mouse strains (C57BL/6N, C3H/He, and 129/Sv) were used, and many offspring were obtained when FD sperm that was preserved for 3 months at RT (26-28% vs. 6-11% of without trehalose) was used. However, when DNA damage in FD sperm was examined by gamma-H2Ax assays, it was found that trehalose failed to protect the FD sperm from DNA damage. These results suggest that trehalose has the potential to protect other sperm factors rather than sperm DNA during preservation at RT for longer periods and trehalose is more effective for inbred mouse strains.