完全長スキャフォールディングタンパク質NHERF1の動的構造がシグナル伝達複合体の形成に影響を与える

Dynamic structure of the full-length scaffolding protein NHERF1 influences signaling complex assembly.

• Shibani Bhattacharya
• Christopher B Stanley
• William T Heller
• Peter A Friedman
• Zimei Bu

抄録

Na/H交換調節因子1（NHERF1）タンパク質は、膜貫通型Gタンパク質共役型受容体（GPCR）やイオン輸送タンパク質の集合体や細胞内輸送を、膜-細胞骨格アダプタータンパク質であるエズリンとともに制御している。ここでは、溶液NMRと中性子小角散乱（SANS）を用いて、完全長のNHERF1と、リン酸塩ホメオスタシスの障害に関与する疾患関連変異体の構造的特徴を明らかにした。NHERF1は、構造的に独立した2つのPDZドメインから構成されており、柔軟性のある無秩序なリンカーで連結されている。その結果、NHERF1の超長距離で無秩序なC末端尾部には1型PDZ結合モチーフがあり、近位の2番目のPDZドメインと弱く相互作用して動的に自己抑制構造を形成していることが明らかになった。SANSデータのアンサンブル最適化解析を用いて、フレキシブルチェーンがサンプリングした広範な構造空間から構造の分子サイズ分布を抽出した。その結果、NHERF1は多様なPDZドメイン構造と無秩序なC末端尾の拡散アンサンブルであることが明らかになった。また、3つの疾患変異体（L110V, R153Q, E225K）のNMR/SANSデータの共同解析により、局所的なPDZドメイン構造と大域的なコンフォメーションにWTタンパク質と比較して有意な違いがあることが明らかになった。さらに、これらの置換がNHERF1のezrinおよびGタンパク質共役型受容体キナーゼ6A（GRK6A）のC末端ペプチドとの結合の親和性と速度に影響を与えることも明らかにした。これらの知見は、シグナル伝達複合体のダイナミックな集合体を変化させる疾患関連の点突然変異によるNHERF1の本質的な柔軟性の変調についての重要な知見を提供するものである。

The Na/H exchange regulatory cofactor 1 (NHERF1) protein modulates the assembly and intracellular trafficking of several transmembrane G protein-coupled receptors (GPCRs) and ion transport proteins with the membrane-cytoskeleton adapter protein ezrin. Here, we applied solution NMR and small-angle neutron scattering (SANS) to structurally characterize full-length NHERF1 and disease-associated variants that are implicated in impaired phosphate homeostasis. Using NMR, we mapped the modular architecture of NHERF1, which is composed of two structurally-independent PDZ domains that are connected by a flexible, disordered linker. We observed that the ultra-long and disordered C-terminal tail of NHERF1 has a type 1 PDZ-binding motif that interacts weakly with the proximal, second PDZ domain to form a dynamically autoinhibited structure. Using ensemble-optimized analysis of SANS data, we extracted the molecular size distribution of structures from the extensive conformational space sampled by the flexible chain. Our results revealed that NHERF1 is a diffuse ensemble of variable PDZ domain configurations and a disordered C-terminal tail. The joint NMR/SANS data analyses of three disease variants (L110V, R153Q, and E225K) revealed significant differences in the local PDZ domain structures and in the global conformations compared with the WT protein. Furthermore, we show that the substitutions affect the affinity and kinetics of NHERF1 binding to ezrin and to a C-terminal peptide from G protein-coupled receptor kinase 6A (GRK6A). These findings provide important insight into the modulation of the intrinsic flexibility of NHERF1 by disease-associated point mutations that alter the dynamic assembly of signaling complexes.

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