マイクロRNA-32は、E2F転写因子5を標的とすることで、ヒト大腸がん細胞株の増殖、遊走、浸潤を抑制する

MicroRNA-32 inhibits the proliferation, migration and invasion of human colon cancer cell lines by targeting E2F transcription factor 5.

• F Yang
• L Chen
• Z-J Wang

抄録

目的:

マイクロRNAは、がんなどの疾患の治療に欠かせない治療標的となることが期待されています。大腸がんは、有病率の高いがんの一つであり、その原因となる死亡率は非常に高い。大腸がんの治療は、診断の遅れや効率的な治療標的がないために制限されています。ここでは、大腸がんにおけるmiR-32の治療効果について検討しました。

OBJECTIVE: MicroRNAs to be essential therapeutic targets for the treatment of diseases such as cancer. Colon cancer is one of the prevalent cancers and causes tremendous human mortality. The treatment of colon cancer is limited by late diagnosis and lack of efficient therapeutic targets. Herein, the therapeutic potential of the miR-32 was explored in colon cancer.

患者および方法:

発現解析は、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）により行った。トランスフェクションは、リポフェクタミン®2000試薬を用いて行った。細胞生存率を決定するために、セルカウンティングキット８（ＣＣＫ-８）アッセイを用いた。アポトーシスの検出には、４'，６-ジアミノ-２-フェニルインドール（ＤＡＰＩ）およびアネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）アッセイを使用した。トランスウェルアッセイは、細胞の遊走および浸潤を決定するために使用した。タンパク質の発現はウエスタンブロット法で推定した。

PATIENTS AND METHODS: Expression analysis was carried out by quantitative Real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Transfections were performed by Lipofectamine® 2000 reagent. The cell counting kit 8 (CCK-8) assay was used to determine cell viability. The 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and annexin V/Propidium Iodide (PI) assays were used for the detection of apoptosis. Transwell assays were used to determine cell migration and invasion. The expression of the proteins was estimated by Western blotting.

結果:

その結果、すべての結腸癌細胞においてmiR-32の発現が異常にダウンレギュレーションされていることが明らかになった。miR-32を過剰発現させると、アポトーシスの誘導を介してSW-948細胞の生存率が有意に（p<0.01）低下した。また、アポトーシスの誘導には、BaxのアップレギュレーションとBcl-2発現のダウンレギュレーションも伴っていた。miR-32の過剰発現はまた、SW-498細胞の細胞周期のG2/M期での停止を引き起こし、細胞の遊走と浸潤を抑制した。TargetScan解析により、E2F転写因子5（E2F5）がmiR-32の潜在的な標的であることが示され、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイによっても確認された。E2F5の発現は大腸がん細胞で有意に（p<0.01）上昇し、miR-32を過剰発現させるとSW-948細胞ではE2F5の発現がかなり低下した。また、E2F5サイレンシングは、アポトーシスやG2/M細胞周期停止を介してSW-948細胞の増殖を抑制した。また、MiR-32 の過剰発現は SW-948 細胞の遊走と浸潤を抑制した。しかし、レスキューアッセイにより、E2F5がmiR-32の腫瘍抑制効果に必須であることが明らかになった。

RESULTS: The results showed that the expression of miR-32 was aberrantly downregulated in all colon cancer cells. Overexpression of miR-32 caused significant (p<0.01) decline in the viability in SW-948 cells via induction of apoptosis. The induction of apoptosis was also accompanied by the upregulation of Bax and downregulation of Bcl-2 expression. Overexpression of miR-32 also caused the arrest of the SW-498 cells in the G2/M phase of cell cycle and inhibited their migration and invasion. TargetScan analysis showed E2F transcription factor 5 (E2F5) to be the potential target of miR-32, which was also confirmed by dual luciferase reporter assay. The expression of E2F5 was significantly (p<0.01) upregulated in the colon cancer cells and overexpression of miR-32 caused a considerable decline in the expression of E2F5 in the SW-948 cells. E2F5 silencing also inhibited the growth of the SW-948 cells via induction of apoptosis and G2/M cell cycle arrest. MiR-32 overexpression also inhibited the migration and invasion of the SW-948 cells. However, rescue assay revealed E2F5 to be essential for the tumor suppressive effects of miR-32.

結論:

本研究の結果から、miR-32が大腸がん細胞の腫瘍抑制作用を持つことが明らかになり、大腸がん治療において治療的な意味合いを持つ可能性があることがわかりました。

CONCLUSIONS: The findings of the present study reveal that miR-32 acts as a tumor suppressor in colon cancer cells and may have therapeutic implications in colon cancer treatment.