G3BPの分離ドメインは、アルファウイルス複製複合体の効率的なクラスタリングと翻訳開始機構のリクルートを促進する

Separate domains of G3BP promote efficient clustering of alphavirus replication complexes and recruitment of the translation initiation machinery.

• Benjamin Götte
• Marc D Panas
• Kirsi Hellström
• Lifeng Liu
• Baila Samreen
• Ola Larsson
• Tero Ahola
• Gerald M McInerney

抄録

G3BP-1および-2（以下、G3BP）は、ストレス顆粒（SG）の組み立てに関与する多機能RNA結合タンパク質であり、様々なファミリーのウイルスがG3BPを標的にして複製や転写複合体へのリクルートを行い、SGの組み立てを阻害していますが、他の未知の機能を介してプロウイルス効果を獲得しています。様々なファミリーのウイルスは、G3BPを標的にして、SGアセンブリを阻害するために複製複合体や転写複合体へのリクルートを行うが、G3BPの他の未知の機能を介してプロウイルス効果を獲得することもある。セムリキフォレストウイルス（SFV）やチクングニアウイルス（CHIKV）などの旧世界のアルファウイルスは、ウイルス非構造タンパク質3（nsP3）のC末端にあるFGDFモチーフとG3BPのNTF2様ドメインとの相互作用を介して、G3BPをウイルス複製複合体にリクルートしている。G3BPの潜在的なプロウイルス的役割を研究するために、CRISPR-Cas9を用いて生成した内因性G3BPを欠失したヒト骨肉腫（U2OS）細胞株を用いて、G3BP1変異体および切断変異体のパネルで再構成した。SFVはすべての細胞株で様々な効率で複製したが、CHIKVはNTF2様ドメインとRGGドメインの両方を含むG3BP1変異体を発現する細胞でのみ複製できた。G3BPが存在しない場合にSFVが複製する能力は、タンパク質の異なるドメインの効果を研究することを可能にした。我々は、NTF2様ドメインとRGGドメインの両方が、nsP3、G3BP1および40Sリボソームサブユニット間の複合体の形成に必要であることを示すために免疫沈降を使用した。SFV感染細胞の電子顕微鏡観察の結果、NTF2様ドメインを介したnsP3:G3BP1複合体の形成は、細胞質液胞（CPV）のクラスタリングに必要であり、RGGドメインの存在は、CPVクラスタの周囲にG3BP1とnsP3を含む電子密度の高い物質が蓄積するために必要であることが明らかになった。また、クラスター化されたCPVは、リボプロマイシン化染色によって検出されるように、ウイルスmRNAの翻訳が局在的に高いレベルで発現していた。これらのデータは、G3BPがリボソーム結合タンパク質であることを確認し、アルファウイルスnsP3がG3BPを用いてウイルス複製複合体を集中させ、翻訳開始機構をリクルートし、ウイルスmRNAの効率的な翻訳を促進していることを明らかにした。

G3BP-1 and -2 (hereafter referred to as G3BP) are multifunctional RNA-binding proteins involved in stress granule (SG) assembly. Viruses from diverse families target G3BP for recruitment to replication or transcription complexes in order to block SG assembly but also to acquire pro-viral effects via other unknown functions of G3BP. The Old World alphaviruses, including Semliki Forest virus (SFV) and chikungunya virus (CHIKV) recruit G3BP into viral replication complexes, via an interaction between FGDF motifs in the C-terminus of the viral non-structural protein 3 (nsP3) and the NTF2-like domain of G3BP. To study potential proviral roles of G3BP, we used human osteosarcoma (U2OS) cell lines lacking endogenous G3BP generated using CRISPR-Cas9 and reconstituted with a panel of G3BP1 mutants and truncation variants. While SFV replicated with varying efficiency in all cell lines, CHIKV could only replicate in cells expressing G3BP1 variants containing both the NTF2-like and the RGG domains. The ability of SFV to replicate in the absence of G3BP allowed us to study effects of different domains of the protein. We used immunoprecipitation to demonstrate that that both NTF2-like and RGG domains are necessary for the formation a complex between nsP3, G3BP1 and the 40S ribosomal subunit. Electron microscopy of SFV-infected cells revealed that formation of nsP3:G3BP1 complexes via the NTF2-like domain was necessary for clustering of cytopathic vacuoles (CPVs) and that the presence of the RGG domain was necessary for accumulation of electron dense material containing G3BP1 and nsP3 surrounding the CPV clusters. Clustered CPVs also exhibited localised high levels of translation of viral mRNAs as detected by ribopuromycylation staining. These data confirm that G3BP is a ribosomal binding protein and reveal that alphaviral nsP3 uses G3BP to concentrate viral replication complexes and to recruit the translation initiation machinery, promoting the efficient translation of viral mRNAs.