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液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法によるヒト血漿中のストレス誘発バイオマーカーの定量的モニタリング：うつ病患者と健常者の比較研究への応用
Quantitative monitoring of a panel of stress-induced biomarkers in human plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: an application in a comparative study between depressive patients and healthy subjects.
PMID: 31201457 DOI: 10.1007/s00216-019-01956-2.
抄録
メタボローム解析の手法を用いて、ストレスがクレアチン/ホスホクレアチンシャトルシステムとプリンナリン経路を阻害することで酸化的損傷を誘発し、過剰な膜破壊を引き起こすことを明らかにしました。私たちの知見をさらに検証し、精神科臨床研究におけるストレスの生物学的影響をモニターするために、ヒト血漿中のコリン、クレアチン、プリンリン作動性代謝物、ニューロステロイド、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンからなるバイオマーカーを同時に測定する液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法（LC-MS/MS）を開発しました。抽出プロトコルを最適化した後、15種類の分析物と極性の異なる4種類の内部標準物質をメチル-tert-ブチルエーテル/メタノール(1:1, v/v)を用いて有機相に抽出した。5mM酢酸アンモニウム緩衝液（0.1%ギ酸を含む）の水相Aとアセトニトリル/2-プロパノール（3:7, v/v）の有機相Bからなる逆相C8カラムを用いて、勾配溶出を行った。正イオンまたは負イオンモードでの4つの連続した期間を組み合わせて、特定の多重反応モニタリング遷移を持つ分析物の定量を行いました。すべての分析物について、この方法は決定係数(R)が0.99以上で良好な直線性を示しました。定量下限値（LLOQ）は0.05～80.0ng/mLでした。粉末活性炭で除去した血漿試料に標準物質を添加することにより、70.5～97.3%の回収率が得られた。分析結果の測定範囲内および測定間の相対標準偏差（RSD）は2.0～13.3%の間で変動した。平均精度は90.6から109.0%であった。マトリックス効果は91.2～107.3％であり、変動は9.0％未満であった。また、異なる条件下での安定性もテストされ、平均回収率は90.4～109.7%であった。最後に，確立された方法を，大うつ病性障害患者 30 人と健常対照者 30 人の小規模コホートの血漿サンプルの分析に適用することに成功した．グラフィカル・アブストラクト。
Using a metabolomic approach, we have found that stress can induce oxidative damage by disturbing the creatine/phosphocreatine shuttle system and purinergic pathway, leading to an excessive membrane breakdown. To further validate our findings and to monitor the biological impact of stress in research of clinical psychiatry, a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was developed to simultaneously determine a panel of biomarkers comprising choline, creatine, purinergic metabolites, neurosteroids, lysophosphatidylcholines, and phosphatidylethanolamines in human plasma. After optimization of the extraction protocol, all the 15 analytes plus 4 internal standards with distinct polarities were extracted into an organic phase using methyl tert-butyl ether/methanol (1:1, v/v). A reversed-phase C8 column under gradient elution consisting of aqueous phase A of 5 mM ammonium acetate buffer solution containing 0.1% formic acid and organic phase B of acetonitrile/2-propanol (3:7, v/v) was utilized for separation. Four sequential periods under positive or negative ion mode were combined for the determination of analytes with specific multiple reaction monitoring transitions. For all analytes, this method exhibited good linearity with coefficients of determination (R) higher than 0.99. The lower limit of quantification (LLOQ) values ranged from 0.05 to 80.0 ng/mL. Recovery between 70.5 and 97.3% was obtained by spiking standards to plasma samples stripped by powdered activated carbon. The intra- and inter-assay relative standard deviations (RSDs) of the analyses varied between 2.0 and 13.3%. The mean accuracy ranged from 90.6 to 109.0%. The matrix effect ranged from 91.2 to 107.3% with variations less than 9.0%. Stability under different conditions was tested, with mean recoveries varying between 90.4 and 109.7%. Finally, the established method was successfully applied to analyze the plasma samples from a small cohort of 30 patients with major depressive disorder and 30 matched healthy controls. Graphical abstract.