マルチプルLAMPとラテラルフローディップスティックによる感染性気管支炎ウイルスとニューカッスル病ウイルスの同時検出と可視化

Simultaneous and visual detection of infectious bronchitis virus and Newcastle disease virus by multiple LAMP and lateral flow dipstick.

• Xuan Wu
• Zengxu Song
• Xiwen Zhai
• Lei Zuo
• Xueran Mei
• Rong Xiang
• Zhuangzhuang Kang
• Long Zhou
• Hongning Wang

抄録

感染性気管支炎ウイルス（IBV）とニューカッスル病ウイルス（NDV）は、世界の家禽産業に深刻な影響を与える重要なウイルスである。本研究では、逆転写LAMP（RT-LAMP）とラテラルフローディプスティック（LFD）を組み合わせることで、IBVとNDVを同時に目視で検出できる新しい検出ツールを開発した。プライマーはIBVゲノムの5'-UTR（5'-非翻訳領域）とNDVラージポリメラーゼ遺伝子（LP）の保存領域を標的とした。この多重逆転写-ＬＡＭＰ-ＬＦＤ（ｍＲＴ-ＬＡＭＰ-ＬＦＤ）アッセイの特異性および感度を、従来のＲＴ-ＰＣＲ、ネステッドＲＴ-ＰＣＲ（ｎＲＴ-ＰＣＲ）、定量ＲＴ-ＰＣＲ（ｑＲＴ-ＰＣＲ）、および電気泳動によるＲＴ-ＬＡＭＰモニターと比較した。非特異的増幅は、無関係のウイルスでアッセイを行った場合には観察されなかった。感度調査によると、IBVまたはNDVを単独で検出した場合、mRT-LAMP-LFDの最低検出限界は、IBV RNAコピー/反応100.8およびNDV RNAコピー/反応100.7であった。さらに、IBVとNDVを同時に検出した場合の最低検出限界は、単独検出アッセイと同じであった。臨床サンプル試験では、mRT-LAMP-LFDがこれらのアッセイの中で最も優れたパフォーマンスを示した。IBVまたはNDV単独感染サンプルで試験した場合、平均検出率はそれぞれ98.65％および97.25％であった。IBVとNDVの共感染サンプルで試験した場合、IBVとNDVの平均検出率はともに95％であった。この研究は、mRT-LAMP-LFDがフィールドでの単一または複数のIBVおよびNDVの検出に適した有望な定性検出ツールであることを示した。

Infectious bronchitis virus (IBV) and Newcastle disease virus (NDV) are both important viruses seriously affecting poultry industry worldwide. In this study, reverse-transcription LAMP (RT-LAMP) was combined with lateral flow dipstick (LFD) forming a novel detection tool which could simultaneously detect IBV and NDV visually. Primers targeted the 5'-untranslated region (5'-UTR) of IBV genome and the conserved region of NDV large polymerase gene (LP). The specificity and sensitivity of this multiple reverse transcription-LAMP-LFD (mRT-LAMP-LFD) assay were compared with those of conventional RT-PCR, nested RT-PCR (nRT-PCR), quantification RT-PCR (qRT-PCR), and RT-LAMP monitored by electrophoresis. No non-specific amplifications were observed when the assays were tested with unrelated viruses. According to the sensitivity study, when detecting IBV or NDV alone, the lowest detection limits of mRT-LAMP-LFD were 100.8 IBV RNA copies/reaction and 100.7 NDV RNA copies/reaction. Furthermore, when detecting IBV and NDV simultaneously, the lowest detection limit was the same as that of the single detection assays. In the clinical sample study, mRT-LAMP-LFD performed the best among these assays. When tested with IBV or NDV single infected samples, the mean detection rates were 98.65% and 97.25%, respectively. In the IBV and NDV co-infected sample study, the mean detection rates of IBV and NDV were both 95%. This study showed that mRT-LAMP-LFD was a promising qualitative detection tool suitable for field single or multiple IBV and NDV detection.

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