カルシウム感知受容体の内部化はアルレチンに依存し、アロステリックリガンドによって制御される

Calcium-Sensing Receptor Internalization Is -Arrestin-Dependent and Modulated by Allosteric Ligands.

• Iris Mos
• Stine E Jacobsen
• Simon R Foster
• Hans Bräuner-Osborne

抄録

G タンパク質共役型受容体（GPCR）の内部化は GPCR 活性の停止に重要であり、場合によっては G タンパク質非依存性シグナリングやエンドソーム受容体シグナリングと関連している。これまでにクラス A の GPCR の内部化については詳細に研究されてきたが、細胞外カルシウム感知受容体（CaSR）を含むクラス C の GPCR にどの程度まで一般化できるのかはよくわかっていない。CaSR は、細胞外遊離 Ca の微小な変化を感知して血中カルシウム（Ca）濃度を安定に維持するクラス C GPCR の一種であり、CaSR の活性は、内因性アゴニストに継続的に曝露されていても厳密に制御されていることが必要である。これまでの研究では、CaSR の内部化を調べるための間接的な手段として、GPCR トラフィッキングに関与する細胞内タンパク質の過剰発現、経路阻害剤、細胞表面の発現または機能的脱感作を用いてきた。しかし、その過程については一般的なコンセンサスが得られておらず、CaSRの内部化のメカニズムについては未だ十分な理解が得られていないのが現状です。本研究では、CaSRの内部化機構について新たな知見を得ることができた。我々は、最先端の時間分解蛍光共鳴エネルギー移動に基づく内包化アッセイを用いて、CaSRの内包化をリアルタイムで直接測定した。その結果、CaSRは構成的な内包化と濃度依存的な内包化の両方を示すことを明らかにした。また、CaSRの内在化は、CaSR特異的アロステリックモジュレーターである-(3-[2-クロロフェニル]プロピル)-()--メチル-3-メトキシベンジルアミン(NPS R-568)と2-クロロ-6-[(2)-2-ヒドロキシ-3-[(2-メチル-1-ナフタレン-2-イルプロパン-2-イル)アミノ]プロポキシ]ベンゾニトリル(NPS 2143)による即時的な正負の変調に敏感であることを初めて明らかにした。さらに、CaSRの内部化は、GおよびGタンパク質のシグナル伝達とは無関係でありながら、-アレスチン依存性であることを証明しました。シグニフィカンス・ステートメント。カルシウム感知受容体（CaSR）の内在化はβ-アレスチン依存性であり、アロステリックリガンドによる調節に敏感であることを示すための、新規の高効率な細胞ベースのリアルタイム内在化アッセイ。

G protein-coupled receptor (GPCR) internalization is crucial for the termination of GPCR activity, and in some cases is associated with G protein-independent signaling and endosomal receptor signaling. To date, internalization has been studied in great detail for class A GPCRs; whereas it is not well established to what extent the observations can be generalized to class C GPCRs, including the extracellular calcium-sensing receptor (CaSR). The CaSR is a prototypical class C GPCR that maintains stable blood calcium (Ca) levels by sensing minute changes in extracellular free Ca It is thus necessary that the activity of the CaSR is tightly regulated, even while continuously being exposed to its endogenous agonist. Previous studies have used overexpression of intracellular proteins involved in GPCR trafficking, pathway inhibitors, and cell-surface expression or functional desensitization as indirect measures to investigate CaSR internalization. However, there is no general consensus on the processes involved, and the mechanism of CaSR internalization remains poorly understood. The current study provides new insights into the internalization mechanism of the CaSR. We have used a state-of-the-art time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based internalization assay to directly measure CaSR internalization in real-time. We demonstrate that the CaSR displays both constitutive and concentration-dependent Ca-mediated internalization. For the first time, we conclusively show that CaSR internalization is sensitive to immediate positive and negative modulation by the CaSR-specific allosteric modulators -(3-[2-chlorophenyl]propyl)-()--methyl-3-methoxybenzylamine (NPS R-568) and 2-chloro-6-[(2)-2-hydroxy-3-[(2-methyl-1-naphthalen-2-ylpropan-2-yl)amino]propoxy]benzonitrile (NPS 2143), respectively. In addition, we provide compelling evidence that CaSR internalization is -arrestin-dependent while interestingly being largely independent of G and G protein signaling. SIGNIFICANCE STATEMENT: A novel highly efficient cell-based real-time internalization assay to show that calcium-sensing receptor (CaSR) internalization is β-arrestin-dependent and sensitive to modulation by allosteric ligands.

Copyright © 2019 by The Author(s).