血管内皮受容体チロシンホスファターゼ：EPHB4およびTIE2との接合体および三元複合体に関連する新規基質の同定

Vascular Endothelial Receptor Tyrosine Phosphatase: Identification of Novel Substrates Related to Junctions and a Ternary Complex with EPHB4 and TIE2.

• Hannes C A Drexler
• Matthias Vockel
• Christian Polaschegg
• Maike Frye
• Kevin Peters
• Dietmar Vestweber

抄録

血管内皮タンパク質チロシンホスファターゼ（VE-PTP、PTPRB）は、内皮ジャンクションと血管の発達を制御するために重要な受容体型ホスファターゼである。我々は近年、VE-PTPがアンジオポエチン受容体TIE2、内皮接着接合タンパク質VE-カドヘリン、血管内皮成長因子受容体VEGFR2など、内皮接合体の安定性に重要な役割を果たす基質を脱リン酸化することで血管の健全性を調節していることを明らかにしてきた。ここでは、2 つのアプローチを用いて、内皮細胞における VE-PTP の新規基質を系統的に探索した。第一に、我々は、高VE-PTP特異的ホスファターゼ阻害剤に細胞を曝露した際の内皮リン酸プロテオームの変化を調べ、その後、ホスホチロシン特異的抗体を用いてリン酸化タンパク質のアフィニティー単離と質量分析を行った。第二に、我々は、SILACベースの定量的質量分析測定と組み合わせて、リン酸化された基質をプルダウンするためにVE-PTPの基質トラップ変異体を使用しています。その結果、VE-PTPの基質候補を同定したが、そのうちの29％が細胞接合に関連していることがわかった。これらの基質候補のいくつかは、両方のスクリーンで発見され、予測された機能的相互作用ネットワークにおいて非常に高い連結性を示した。受容体タンパク質チロシンキナーゼEPHB4は、両プロテオミクス手法により同定されたVE-PTPターゲットの中で、VE-PTP阻害時に最もリン酸化されたタンパク質であった。さらに、EPHB4は内皮細胞において、VE-PTPおよびTIE2と三元的な複合体を形成していることが明らかになった。VE-PTPは、これら2つのチロシンキナーゼ受容体のそれぞれのリン酸化を制御している。VE-PTPとTIE2は同時に三元複合体を形成しているにもかかわらず、それぞれの受容体を特異的なリガンドで刺激しても、それぞれのパートナー受容体は交差活性化されなかった。このように、我々の系統的なアプローチにより、VE-PTPの新規な基質の同定につながり、その多くが細胞接合体の制御に関連していることが明らかになった。

Vascular endothelial protein tyrosine phosphatase (VE-PTP, PTPRB) is a receptor type phosphatase that is crucial for the regulation of endothelial junctions and blood vessel development. We and others have shown recently that VE-PTP regulates vascular integrity by dephosphorylating substrates that are key players in endothelial junction stability, such as the angiopoietin receptor TIE2, the endothelial adherens junction protein VE-cadherin and the vascular endothelial growth factor receptor VEGFR2. Here, we have systematically searched for novel substrates of VE-PTP in endothelial cells by utilizing two approaches. First, we studied changes in the endothelial phosphoproteome on exposing cells to a highly VE-PTP-specific phosphatase inhibitor followed by affinity isolation and mass-spectrometric analysis of phosphorylated proteins by phosphotyrosine-specific antibodies. Second, we used a substrate trapping mutant of VE-PTP to pull down phosphorylated substrates in combination with SILAC-based quantitative mass spectrometry measurements. We identified a set of substrate candidates of VE-PTP, of which a remarkably large fraction (29%) is related to cell junctions. Several of those were found in both screens and displayed very high connectivity in predicted functional interaction networks. The receptor protein tyrosine kinase EPHB4 was the most prominently phosphorylated protein on VE-PTP inhibition among those VE-PTP targets that were identified by both proteomic approaches. Further analysis revealed that EPHB4 forms a ternary complex with VE-PTP and TIE2 in endothelial cells. VE-PTP controls the phosphorylation of each of these two tyrosine kinase receptors. Despite their simultaneous presence in a ternary complex, stimulating each of the receptors with their own specific ligand did not cross-activate the respective partner receptor. Our systematic approach has led to the identification of novel substrates of VE-PTP, of which many are relevant for the control of cellular junctions further promoting the importance of VE-PTP as a key player of junctional signaling.

© 2019 Drexler et al.