Selenoprotein S Positive UGA Recoding (SPUR)要素の同定とその位置依存性活性

Identification of the Selenoprotein S Positive UGA Recoding (SPUR) element and its position-dependent activity.

• Eric M Cockman
• Vivek Narayan
• Belinda Willard
• Sumangala P Shetty
• Paul R Copeland
• Donna M Driscoll

抄録

セレンタンパク質は、21アミノ酸のセレノシステイン（Sec）を含むタンパク質のユニークなクラスです。タンパク質への Sec の付加は UGA ストップコドンの再コードによって達成されます。すべての25の哺乳類セレノタンパク質mRNAは、Secの組み込みに必要な3'UTRステムループ構造、セレノシステイン挿入配列(SECIS)を持っています。SECISはSecの挿入を制御する主要なRNA要素であると広く信じられているが、我々の研究室での最近の発見は、Selenoprotein S (SelS)についてはそうではないことを示唆している。ここでは、SelSの3'UTRの最初の91ヌクレオチドが近位ステムループ(PSL)と我々がSelSポジティブUGAリコード(SPUR)要素と名付けた保存配列を含むことを報告する。我々は、UGAリコーディングのためのSelS-V5/UGAサロゲートアッセイを開発し、これは、細胞内のSecの組み込みの正確な測定値であることが質量分析によって検証された。このアッセイを用いて、SPURエレメントの点突然変異がレポーターにおける再コードを大幅に減少させることを示した。対照的に、PSLを欠失させると、Secの取り込みが増加した。この効果は、PSLを他のステムループや構造化されていない配列で置換した場合に逆転した。追加の研究により、UGA-Secコドンに対するSPURの位置が最適なUGA再コードに重要であることが明らかになった。このことから、SelSの3'UTRにおけるSPUR要素の同定は、これまでに考えられていたよりも複雑なSec挿入の制御を明らかにするものである。

Selenoproteins are a unique class of proteins that contain the 21 amino acid, selenocysteine (Sec). Addition of Sec into a protein is achieved by recoding of the UGA stop codon. All 25 mammalian selenoprotein mRNAs possess a 3' UTR stem-loop structure, the Selenocysteine Insertion Sequence (SECIS), which is required for Sec incorporation. It is widely believed that the SECIS is the major RNA element that controls Sec insertion, however recent findings in our lab suggest otherwise for Selenoprotein S (SelS). Here we report that the first 91 nucleotides of the SelS 3' UTR contain a proximal stem loop (PSL) and a conserved sequence we have named the SelS Positive UGA Recoding (SPUR) element. We developed a SelS-V5/UGA surrogate assay for UGA recoding, which was validated by mass spectrometry to be an accurate measure of Sec incorporation in cells. Using this assay, we show that point mutations in the SPUR element greatly reduce recoding in the reporter; thus, the SPUR is required for readthrough of the UGA-Sec codon. In contrast, deletion of the PSL increased Sec incorporation. This effect was reversed when the PSL was replaced with other stem-loops or an unstructured sequence, suggesting that the PSL does not play an active role in Sec insertion. Additional studies revealed that the position of the SPUR relative to the UGA-Sec codon is important for optimal UGA recoding. Our identification of the SPUR element in the SelS 3' UTR reveals a more complex regulation of Sec incorporation than previously realized.