フェノバルビタールを介したヒトではなくマウスのプレグナンX受容体の活性化機構の解明

Mechanistic Insights of Phenobarbital-Mediated Activation of Human but Not Mouse Pregnane X Receptor.

• Linhao Li
• Matthew A Welch
• Zhihui Li
• Bryan Mackowiak
• Scott Heyward
• Peter W Swaan
• Hongbing Wang

抄録

フェノバルビタール（PB）は、広く使用されている抗てんかん薬であり、構成性アンドロステン受容体（CAR）の活性化によりチトクローム P450 の誘導剤として初めて特徴づけられた。PBは、間接的な活性化メカニズムを介して、種の間で保存されているCAR活性化因子として認識されているが、CARの姉妹受容体であるプレグナンX受容体（PXR）に対するPBの調節については、相反する結果が報告されており、その基礎となるメカニズムは不明なままであった。ここでは、ヒトCAR（hCAR）ノックアウト（KO）HepaRG細胞株において、PBがhCARとヒトPXR（hPXR）の共通の標的遺伝子であるCYP2B6とCYP3A4の発現を有意に誘導することを示した。ヒト初代肝細胞およびhCAR-KO HepaRG細胞において、PBによるCYP3A4の発現は、遺伝子ノックダウンやhPXRの薬理学的阻害によって著しく抑制された。PB 濃度依存的に hPXR を活性化したが、マウスのルシフェラーゼアッセイでは活性化しなかった。哺乳類の二種混合アッセイでは、PB はステロイド受容体コアクチベーター-1 と hPXR との間の機能的相互作用を選択的に増加させるが、マウス PXR は増加させないことが実証された。さらに、表面プラズモン共鳴結合親和性アッセイにより、PB は hPXR のリガンド結合ドメインに直接結合することが示された（K = 1.42 × 10）。構造活性解析により、hPXRのリガンド結合ポケット内のアミノ酸トリプトファン-299がPBのアゴニスティック結合に重要な役割を果たし、トリプトファン-299の変異がhPXRのPB活性化を阻害することがさらに明らかになった。これらのデータは、マウスCARの選択的活性化因子であるPBがhCARとhPXRの両方を活性化することを明らかにし、PBが媒介するhPXRの活性化の新たなメカニズムを提供するものである。

Phenobarbital (PB), a broadly used antiseizure drug, was the first to be characterized as an inducer of cytochrome P450 by activation of the constitutive androstane receptor (CAR). Although PB is recognized as a conserved CAR activator among species via a well-documented indirect activation mechanism, conflicting results have been reported regarding PB regulation of the pregnane X receptor (PXR), a sister receptor of CAR, and the underlying mechanisms remain elusive. Here, we show that in a human CAR (hCAR)-knockout (KO) HepaRG cell line, PB significantly induces the expression of CYP2B6 and CYP3A4, two shared target genes of hCAR and human PXR (hPXR). In human primary hepatocytes and hCAR-KO HepaRG cells, PB-induced expression of CYP3A4 was markedly repressed by genetic knockdown or pharmacological inhibition of hPXR. Mechanistically, PB concentration dependently activates hPXR but not its mouse counterpart in cell-based luciferase assays. Mammalian two-hybrid assays demonstrated that PB selectively increases the functional interaction between the steroid receptor coactivator-1 and hPXR but not mouse PXR. Moreover, surface plasmon resonance binding affinity assay showed that PB directly binds to the ligand binding domain of hPXR (K = 1.42 × 10). Structure-activity analysis further revealed that the amino acid tryptophan-299 within the ligand binding pocket of hPXR plays a key role in the agonistic binding of PB and mutation of tryptophan-299 disrupts PB activation of hPXR. Collectively, these data reveal that PB, a selective mouse CAR activator, activates both hCAR and hPXR, and provide novel mechanistic insights for PB-mediated activation of hPXR.

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