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精子鞭毛1は、腸管上皮細胞のアクチンと結合し、糸状体と薄板体の形成に関与していることを明らかにした
Sperm Flagellar 1 Binds Actin in Intestinal Epithelial Cells and Contributes to Formation of Filopodia and Lamellipodia.
PMID: 31473225 PMCID: PMC7016487. DOI: 10.1053/j.gastro.2019.08.031.
抄録
精子べん毛1（CLAMPとも呼ばれる）は、多繊毛細胞の微小管ダイナミクスと平面細胞極性を制御する微小管関連タンパク質である。我々は、ヒト腸管上皮細胞（IEC）における精子べん毛1（CLAMP）の局在と機能を調べた。
BACKGROUND & AIMS: Sperm flagellar 1 (also called CLAMP) is a microtubule-associated protein that regulates microtubule dynamics and planar cell polarity in multi-ciliated cells. We investigated the localization and function of sperm flagellar 1, or CLAMP, in human intestinal epithelia cells (IECs).
方法:
SKCO-15と、ドナー1名の異なる腸管セグメント（十二指腸、空腸、回腸、大腸）の生検から樹立されたヒト腸管エンテロイドを用いた研究を行った。腸管内腸管は、成長因子でインキュベートした後、分化誘導した。IECにおける内因性CLAMPの分布を、全内部反射蛍光-基底状態枯渇および共焦点顕微鏡を用いた免疫蛍光顕微鏡で解析した。CLAMP の局在化は、腸管上皮細胞の分極過程において、細胞が平坦な単分子膜からコンパクトでコンフルエントな単分子膜へと進行する過程で追跡された。内因性CLAMPとのタンパク質相互作用は、SKCO-15細胞において、近接ライゲーションアッセイと共免疫沈降法を用いて決定された。小型ヘアピンＲＮＡを用いてＳＫＣＯ-１５モノレイヤーにおいてＣＬＡＭＰをノックダウンし、細胞を免疫ブロットおよび免疫蛍光顕微鏡で分析した。移動するSKCO-15細胞におけるCLAMPノックダウンの影響は、スクラッチワウンドアッセイを用いて評価した。
METHODS: We performed studies with SKCO-15 and human intestinal enteroids established from biopsies from different intestinal segments (duodenal, jejunum, ileal, and colon) of a single donor. Enteroids were induced to differentiation after incubation with growth factors. The distribution of endogenous CLAMP in IECs was analyzed by immunofluorescence microscopy using total internal reflection fluorescence-ground state depletion and confocal microscopy. CLAMP localization was followed during the course of intestinal epithelial cell polarization as cells progressed from flat to compact, confluent monolayers. Protein interactions with endogenous CLAMP were determined in SKCO-15 cells using proximity ligation assays and co-immunoprecipitation. CLAMP was knocked down in SKCO-15 monolayers using small hairpin RNAs and cells were analyzed by immunoblot and immunofluorescence microscopy. The impact of CLAMP knock-down in migrating SKCO-15 cells was assessed using scratch-wound assays.
結果:
CLAMPはアクチンとアピカルジャンクション複合体タンパク質に結合したが、IECでは微小管には結合しなかった。CLAMPのカルポニンホモロジードメインはアクチン結合に必要な保存アミノ酸を含んでいることがインシリコ解析により予測された。IEC 分極の間、CLAMP の分布は、未分化細胞では主に基底部ストレス線維と細胞質から、分化した単分子膜では先端膜と微小管に変化した。CLAMPはアクチンと結合して移動する細胞の先端のラメリポディアやフィロポディアに蓄積していた。CLAMPをノックダウンすると、細胞内の糸状体の数が減少し、糸状体の極性が変化し、ラメラポディア内のアクチンフィラメントの組織が変化することが明らかになった。
RESULTS: CLAMP bound to actin and apical junctional complex proteins but not microtubules in IECs. In silico analysis predicted the calponin-homology domain of CLAMP to contain conserved amino acids required for actin binding. During IEC polarization, CLAMP distribution changed from primarily basal stress fibers and cytoplasm in undifferentiated cells to apical membranes and microvilli in differentiated monolayers. CLAMP accumulated in lamellipodia and filopodia at the leading edge of migrating cells in association with actin. CLAMP knock-down reduced the number of filopodia, perturbed filopodia polarity, and altered the organization of actin filaments within lamellipodia.
結論:
CLAMPは、IECでは微小管結合タンパク質ではなく、アクチン結合タンパク質である。CLAMPの分布は、腸管上皮細胞の分極中に変化し、フィロポディアの形成を制御し、移動するIECのラメリポディア内でのアクチン束の組織化を助けているように見える。アクチンと相互作用するCLAMPドメインを定義するための研究が必要であり、また、アクチンがIECから失われると腸の機能に影響を与えるかどうかについても研究が必要である。
CONCLUSIONS: CLAMP is an actin-binding protein, rather than a microtubule-binding protein, in IECs. CLAMP distribution changes during intestinal epithelial cell polarization, regulates the formation of filopodia, and appears to assist in the organization of actin bundles within lamellipodia of migrating IECs. Studies are needed to define the CLAMP domains that interact with actin and whether its loss from IECs affects intestinal function.
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