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犬の成体腎臓上皮幹細胞の特性評価と管状細胞への分化機構の解明
Characterization of Adult Canine Kidney Epithelial Stem Cells That Give Rise to Dome-Forming Tubular Cells.
PMID: 31495275 DOI: 10.1089/scd.2019.0049.
抄録
ドーム形成は、乳腺や腎臓を含む様々な組織に由来する培養管状上皮細胞で起こりうる。ドーム形成性の管状細胞を生じさせる正常な腎臓上皮幹細胞の単離と特徴付けについては、これまで報告されたことがない。我々は、以前に他の成体ヒト幹細胞の単離に用いた簡単な細胞培養法を用いて、イヌの腎臓上皮幹細胞の単離と特徴付けを試みた。ドム形成性腎臓上皮細胞は、解離したイヌの成体腎臓組織から得たもので、-アセチル-l-システイン、l-アスコルビン酸2-リン酸、ニコチンアミド、ウシ胎児血清を添加した修飾ケラチノサイト無血清培地で培養したものである。これらの細胞は、長期培養において高い自己複製能を示した。幹細胞の特徴としては、(1) ギャップ接合部の細胞間コミュニケーションの欠如、(2) アンカレージに依存しない増殖、(3) 八量体結合転写因子4とSRY(性決定領域Y)-ボックス2の発現、(4) 細胞表面マーカーCD24とCD133の発現、(5) 骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、ドーム形成性管状細胞への多能性分化などが挙げられる。これらの特徴の大部分は、よく知られている犬腎管由来の不死化マジンダービー犬腎細胞株と共通している。さらに、本研究で開発されたイヌ腎臓幹細胞は、マトリゲル上に出芽管状オルガノイドを形成し、持続的な成長には高い細胞密度（４０００個／ｃｍ以上）を必要とし、ドーム形成にはコンフルエント性を必要とした。一方、STAT3の活性化因子であるリポ多糖は、コロニー形成効率を用量依存的に増加させた。これらの結果は、細胞密度が高いと STAT3 発現が誘導され、幹細胞の自己再生と管状細胞への分化が促進されるという仮説と一致しています。この新しい細胞培養法は、将来的には臨床応用のための正常ヒト腎臓幹細胞の開発や腎毒性のメカニズムの研究に役立つはずです。
Dome formation can occur in cultured tubular epithelial cells originating from various tissues, including the mammary gland and the kidney. The isolation and characterization of normal kidney epithelial stem cells that give rise to dome-forming tubular cells have never been reported. We attempted to isolate and characterize canine kidney epithelial stem cells using a simple cell culture method that we have previously used to isolate other adult human stem cells. Dome-forming kidney epithelial cells were derived from dissociated adult canine kidney tissues that were cultured in a modified keratinocyte serum-free medium supplemented with -acetyl-l-cysteine, l-ascorbic acid 2-phosphate, nicotinamide, and fetal bovine serum. These cells exhibited high self-renewal capacity in long-term culture (growth for >13 months and 30 cumulative population doublings) and exhibited characteristics of stem cells, including (1) deficiency in gap junctional intercellular communication, (2) anchorage-independent growth, (3) expression of stem cell markers octamer-binding transcription factor 4 and SRY (sex determining region Y)-box 2, (4) expression of cell surface markers CD24 and CD133, and (5) multipotent differentiation into osteoblasts, adipocytes, chondrocytes, and dome-forming tubular cells. Most of these characteristics are shared by the well-known canine renal tubule-derived immortalized Madin-Darby Canine Kidney cell line. Furthermore, the putative canine kidney stem cells developed in this study formed budding tubule-like organoids on Matrigel and required high cell density (>4,000 cells/cm) for sustained growth and confluency for dome formation. The signal transducer and activator of transcription-3 (STAT3) phosphorylation inhibitor, AG490, inhibited colony-forming efficiency and dome formation, whereas lipopolysaccharide, an activator of STAT3, increased colony-forming efficiency in a dose-dependent manner. These results are consistent with the hypothesis that high cell density induces STAT3 expression, which promotes both stem cell self-renewal and differentiation into tubular cells. Our novel cell culture method should be useful for the future development of normal human kidney stem cells for clinical applications and for studying mechanisms of nephrotoxicity.