Gタンパク質共役型受容体40アゴニストGW9508は、INS-1細胞におけるプロテインキナーゼCαおよびεの活性化を介して、グルコース刺激型インスリン分泌を増強する

G-protein-coupled receptor 40 agonist GW9508 potentiates glucose-stimulated insulin secretion through activation of protein kinase Cα and ε in INS-1 cells.

• Takuya Hashimoto
• Hideo Mogami
• Daisuke Tsuriya
• Hiroshi Morita
• Shigekazu Sasaki
• Tatsuro Kumada
• Yuko Suzuki
• Tetsumei Urano
• Yutaka Oki
• Takafumi Suda

抄録

目的:

G タンパク質共役型受容体 40（GPR40）シグナルがプロテインキナーゼ C（PKC）を活性化することでグルコース刺激インスリン分泌を増幅させるメカニズムは不明である。我々は、GPR40アゴニストであるGW9508が、INS-1D細胞の2つのグルコース濃度（3 mMおよび20 mM）で従来および新規のPKCアイソフォームを刺激できるかどうかを調べた。

OBJECTIVE: The mechanism by which G-protein-coupled receptor 40 (GPR40) signaling amplifies glucose-stimulated insulin secretion through activation of protein kinase C (PKC) is unknown. We examined whether a GPR40 agonist, GW9508, could stimulate conventional and novel isoforms of PKC at two glucose concentrations (3 mM and 20 mM) in INS-1D cells.

方法:

エピ蛍光顕微鏡を用いて、細胞内 Ca2+ ([Ca2+]i) の変化のマーカーとして Fura2 の細胞質蛍光強度の相対的な変化をモニターし、GW9508 に対する PKC 活性化のマーカーとしてミリストイル化アラニンリッチ C キナーゼ基質 (MARCKS-GFP) にタグを付けた緑色蛍光タンパク質 (GFP) の相対的な増加を 3 mM および 20 mM のグルコースでモニターした。2つのPKCアイソフォームの活性化を評価するために、PKCα-GFPおよびPKCε-GFPの膜蛍光強度の相対的な増加を全反射蛍光顕微鏡で測定した。各PKCアイソタイプの特異的阻害剤を構築し、Antennapediaのホメオドメインの第3のαヘリックスとのペプチド融合体として合成した。

METHODS: Using epifluorescence microscopy, we monitored relative changes in the cytosolic fluorescence intensity of Fura2 as a marker of change in intracellular Ca2+ ([Ca2+]i) and relative increases in green fluorescent protein (GFP)-tagged myristoylated alanine-rich C kinase substrate (MARCKS-GFP) as a marker of PKC activation in response to GW9508 at 3 mM and 20 mM glucose. To assess the activation of the two PKC isoforms, relative increases in membrane fluorescence intensity of PKCα-GFP and PKCε-GFP were measured by total internal reflection fluorescence microscopy. Specific inhibitors of each PKC isotype were constructed and synthesized as peptide fusions with the third α-helix of the homeodomain of Antennapedia.

結果:

3 mMのグルコースでは、GW9508は、[Ca2+]iの変化に関係なく、細胞質への持続的なMARCKS-GFPの転座を誘導した。20mMのグルコースでは、GW9508は持続的なMARCKS-GFPの細胞質への転座を誘導したが、[Ca2+]iの急激な増加に伴う一過性の転座も誘導した。PKCαの転座はほとんど認められなかったが、3mMグルコースではGW9508によりPKCεの細胞膜への転座が持続した。20mMグルコースでは、GW9508はPKCαの一過性転座と持続的転座を誘導し、PKCεの一過性転座と同様にPKCαの一過性転座を誘導した。各PKCアイソタイプの阻害剤（75μM）は、INS-1D細胞におけるGW9508-potentiated, glucose-stimulated insulin secretionを減少させたが、PKCε阻害剤は、より強力な効果を有していた。

RESULTS: At 3 mM glucose, GW9508 induced sustained MARCKS-GFP translocation to the cytosol, irrespective of changes in [Ca2+]i. At 20 mM glucose, GW9508 induced sustained MARCKS-GFP translocation but also transient translocation that followed sharp increases in [Ca2+]i. Although PKCα translocation was rarely observed, PKCε translocation to the plasma membrane was sustained by GW9508 at 3 mM glucose. At 20 mM glucose, GW9508 induced transient translocation of PKCα and sustained translocation as well as transient translocation of PKCε. While the inhibitors (75 μM) of each PKC isotype reduced GW9508-potentiated, glucose-stimulated insulin secretion in INS-1D cells, the PKCε inhibitor had a more potent effect.

結論:

GW9508はグルコースの副刺激濃度でPKCεを活性化したが、PKCαは活性化しなかった。また，両タイプのPKCはグルコース刺激濃度で活性化され，インスリン産生細胞におけるグルコース刺激型インスリン分泌に寄与した．

CONCLUSION: GW9508 activated PKCε but not PKCα at a substimulatory concentration of glucose. Both PKC isotypes were activated at a stimulatory concentration of glucose and contributed to glucose-stimulated insulin secretion in insulin-producing cells.