in vitro マクロファージモデルにおけるシュウ酸カルシウム一水和物結晶の能動的ファゴサイトーシスと動的処理

Active Phagocytosis and Diachronic Processing of Calcium Oxalate Monohydrate Crystals in an in vitro Macrophage Model.

• Atsushi Okada
• Hiromasa Aoki
• Daichi Onozato
• Taiki Kato
• Tadahiro Hashita
• Hiroshi Takase
• Teruaki Sugino
• Rei Unno
• Kazumi Taguchi
• Shuzo Hamamoto
• Ryosuke Ando
• Kentaro Mizuno
• Keiichi Tozawa
• Tamihide Matsunaga
• Kenjiro Kohri
• Takahiro Yasui

抄録

背景:

腎マクロファージ（Mφs）が腎シュウ酸カルシウム一水和物（COM）結晶を貪食することを以前に発見しました。本研究では、in vitroモデルを用いて、巻き込んだ結晶の処理を調べました。

BACKGROUND: We previously discovered that renal macrophages (Mφs) phagocytose renal calcium oxalate monohydrate (COM) crystals. This study investigated the processing of engulfed crystals using in vitro models.

方法:

J774.1マウスMφをCOM結晶に曝露し、偏光顕微鏡を用いて24時間観察し、貪食阻害剤であるシトカラシンB（CB）の有無にかかわらず、結晶貪食が活発に行われていることを確認しました。リソトラッカーとリソソーム関連膜タンパク質1の透過型電子顕微鏡を用いた免疫組織化学的染色を用いて、リソソームへのCOM結晶の取り込みを確認した。偏光顕微鏡を用いて、巻き込みCOM結晶の処理の全過程を捉えるために、特定のMφを同期的に追跡した。イメージングサイトメトリーを用いた蛍光COM（f-COM）結晶のフォローアップ研究は、酸性小器官のpH勾配を緩和するために、ニゲリシンの存在下および非存在下で行われた。

METHODS: J774.1 mouse Mφs were exposed to COM crystals and observed for 24 h using polarized light microscopy with/without cytochalasin B (CB), an inhibitor of phagocytosis, to confirm active crystal phagocytosis. LysoTracker and immunohistochemical staining using transmission electron microscopy for lysosomal-associated membrane protein 1 were used to confirm engulfed COM crystal uptake into lysosomes. Diachronic tracking of specific Mφs was performed to capture the entire course of engulfed COM crystal processing using polarized light microscopy. Follow-up studies of fluorescent COM (f-COM) crystals using imaging cytometry were performed in the presence and absence of nigericin to dissipate the pH gradient in acidic organelles.

結果:

ファゴサイトーシス率はCOM密度が高いほど増加し、CB処理した細胞では有意に低かった(p < 0.01)。巻き込んだCOM結晶はMφのリソソーム内で凝集していることが観察され、さらに通時的に観察したところ、巻き込んだCOM結晶はMφの分裂中に細分化され、培養7日目までに除去されることが示された。また、イメージングサイトメトリーの結果、48時間後のf-COM結晶の蛍光レベルは、ナイゲリシン(-)群ではナイゲリシン(+)群に比べて有意に低いことが明らかになった。

RESULTS: Phagocytosis rates increased with COM density and were significantly lower in cells treated with CB (p < 0.01). We observed that engulfed crystals colocalized within lysosomes of the Mφs; moreover, diachronic observation indicated that the engulfed COM crystals were subdivided during Mφ division and eliminated by the 7th day of culture. Additionally, imaging cytometry showed that the fluorescence level of f-COM crystals in the nigericin (-) group after 48 h was significantly lower than that in the nigericin (+) group.

結論:

本研究では、MφsがCOM結晶を積極的に貪食し、リソソーム処理していることを確認しました。この発見は、MφsのCOM結晶貪食能を高める将来の薬剤開発に貢献するものと期待されます。

CONCLUSIONS: This study confirmed active phagocytosis and lysosomal processing of engulfed COM crystals by Mφs. This discovery is expected to contribute to the development of future drugs that enhance the COM crystal phagocytic ability of Mφs.

© 2019 The Author(s) Published by S. Karger AG, Basel.