グロビン共役型ジグアニル酸シクラーゼYddVの速度論的解析：ヘム鉄酸化還元状態、軸方向リガンド、ヘム遠位変異が触媒作用に及ぼす影響

Kinetic analysis of a globin-coupled diguanylate cyclase, YddV: Effects of heme iron redox state, axial ligands, and heme distal mutations on catalysis.

• Alzbeta Lengalova
• Veronika Fojtikova-Proskova
• Jakub Vavra
• Václav Martínek
• Martin Stranava
• Toru Shimizu
• Marketa Martinkova

抄録

ヘムベースの酸素センサーは、バクテリアが局所的な酸素濃度に基づいて活性を制御することを可能にします。大腸菌由来のジグアニル酸シクラーゼ活性を有するグロビン結合型酸素センサーYddVは、酸素の利用可能性に基づいて環状-ジ-GMP合成を制御する。本研究では、マルトース結合タンパク質（MBP）に完全長YddVタンパク質を結合させることで、安定な活性サンプルを作製した。全長タンパク質の構造をよりよく理解するために、そのドメイン間の相互作用を速度論的に解析した。YddV-MBPが触媒するジグアニル酸シクラーゼ反応は、ミヒャエルイス-メンテン型の速度論を示した。その最適pHは8.5-9.0であり、触媒にはMgまたはMnが必要であり、他の2価金属イオンでは活性を示さなかった。最も活性の高いYddV-MBPは5配位のFe(III)ヘム錯体を有しており，その速度パラメータはK 84±21μM，k 1.2minであった。ヘムFe(II),ヘムFe(II)-O,ヘムFe(II)-CO錯体を有するYddV-MBPのk値はそれぞれ0.3min, 0.95min, 0.3minであり、触媒作用はヘム鉄の酸化還元状態と軸方向の配位子結合によって制御されていることが示唆された。ヘム遠位アミノ酸を置換したL65G, L65Q, Y43A YddV-MBP変異体のヘム鉄(III)錯体のk値はそれぞれ0.15分, 0.26分, 0.54分であり、ヘム遠位残基がセンシングドメインと機能ドメイン間のシグナル伝達を媒介することにより、重要な制御的役割を果たしていることが示唆された。超遠心分離とサイズ排除クロマトグラフィー実験により、YddV-MBPは溶液中では主に2量体であり、沈降係数は約8であることが示された。不活性なヘムフリーのH93A変異体は主に八量体であり、触媒的に活性な二量体形成にはヘム結合が必要であることが示唆された。

Heme-based oxygen sensors allow bacteria to regulate their activity based on local oxygen levels. YddV, a globin-coupled oxygen sensor with diguanylate cyclase activity from Escherichia coli, regulates cyclic-di-GMP synthesis based on oxygen availability. Stable and active samples of the full-length YddV protein were prepared by attaching it to maltose binding protein (MBP). To better understand the full-length protein's structure, the interactions between its domains were examined by performing a kinetic analysis. The diguanylate cyclase reaction catalyzed by YddV-MBP exhibited Michaelis-Menten kinetics. Its pH optimum was 8.5-9.0, and catalysis required either Mg or Mn; other divalent metal ions gave no activity. The most active form of YddV-MBP had a 5-coordinate Fe(III) heme complex; its kinetic parameters were K 84 ± 21 μM and k 1.2 min. YddV-MBP with heme Fe(II), heme Fe(II)-O, and heme Fe(II)-CO complexes had k values of 0.3 min, 0.95 min, and 0.3 min, respectively, suggesting that catalysis is regulated by the heme iron's redox state and axial ligand binding. The k values for heme Fe(III) complexes of L65G, L65Q, and Y43A YddV-MBP mutants bearing heme distal amino acid replacements were 0.15 min, 0.26 min and 0.54 min, respectively, implying that heme distal residues play key regulatory roles by mediating signal transduction between the sensing and functional domains. Ultracentrifugation and size exclusion chromatography experiments showed that YddV-MBP is primarily dimeric in solution, with a sedimentation coefficient around 8. The inactive heme-free H93A mutant is primarily octameric, suggesting that catalytically active dimer formation requires heme binding.

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