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皮膚糸状菌検出のためのリアルタイムマルチプレックスPCR法の開発と検証
Development and validation of a real-time multiplex PCR assay for the detection of dermatophytes and spp.
PMID: 31526456 DOI: 10.1099/jmm.0.001082.
抄録
爪真菌症は、衰弱性で治療が困難な爪真菌症であり、世界中で流行している。主な病因は皮膚糸状菌であり、表在性真菌症の一般的な原因菌である。真菌培養などの従来の検出法は、感度・特異度が低く、時間がかかるという問題がある。本研究の主な目的は、皮膚糸状菌の検出のためのリアルタイムプローブベースのマルチプレックスqPCRアッセイを設計、開発、検証することであった。また、本研究では、本アッセイの性能特性を評価した。マルチプレックス qPCR アッセイは 4 つの遺伝子を標的とした（アッセイ 1：汎皮膚糸状菌種、アッセイ 2：種）。150 個の真菌分離株を用いて分析検証を行い、204 個の爪標本を用いて臨床検証を行った。性能パラメータは、ゴールドスタンダード（真菌培養）およびエキスパンドゴールドスタンダード（シーケンシングと組み合わせた培養）と比較した。シングルプレックスおよびマルチプレックスqPCRアッセイは、特に拡張ゴールドスタンダードと比較した場合に良好な性能を示した。培養法では，204検体のうち125検体（61.3％）が少なくとも1つの菌に感染しており，そのうち40検体が皮膚糸状菌とsppに陽性であった． 検出された標的菌は，皮膚糸状菌20検体，spp22検体であった． 開発したqPCRアッセイは，検出限界，効率，決定係数，分析感度，臨床感度，特異性に優れていた．また，培養法と比較して迅速な診断が可能であることが確認された。このことは，最適な治療成績を得るための治療戦略の立案に役立つと考えられる．
Onychomycosis is a debilitating, difficult-to-treat nail fungal infection with increasing prevalence worldwide. The main etiological agents are dermatophytes, which are common causative pathogens in superficial fungal mycoses. Conventional detection methods such as fungal culture have low sensitivity and specificity and are time-consuming. The main objective of this study was to design, develop and validate a real-time probe-based multiplex qPCR assay for the detection of dermatophytes and species. The performance characteristics of the qPCR assays were evaluated. The multiplex qPCR assays targeted four genes (assay 1: pan-dermatophytes spp.; assay 2: spp.). Analytical validation was accomplished using 150 fungal isolates and clinical validation was done on 204 nail specimens. The performance parameters were compared against the gold standard (fungal culture) and expanded gold standard (culture in conjunction with sequencing). Both the single-plex and multiplex qPCR assays performed well especially when compared against the expanded gold standard. Among the 204 tested nail specimens, the culture method showed that 125 (61.3 %) were infected with at least one organism, of which 40 yielded positive results for dermatophytes and spp. These target organisms detected include 20 dermatophytes and 22 spp. The developed qPCR assays demonstrated excellent limit of detection, efficiency, coefficient of determination, analytical and clinical sensitivity and specificity. The multiplex qPCR assays were reliable for the diagnosis of onychomycosis, with shorter turn-around time as compared to culture method. This aids in the planning of treatment strategies to achieve optimal therapeutic outcome.