Substance P誘導エクソソームに含まれるMiR-21がヒト大腸上皮細胞の細胞増殖と遊走を促進することを明らかにした

MiR-21 in Substance P-induced exosomes promotes cell proliferation and migration in human colonic epithelial cells.

• Kyriaki Bakirtzi
• Ivy Ka Man Law
• Kai Fang
• Dimitrios Iliopoulos
• Charalabos Pothoulakis

抄録

エクソソソームは、miRNAなどの特殊な分子カーゴを介して細胞間のコミュニケーションに関与する細胞小胞です。エクソソソームには、神経ペプチド/ホルモンであるサブスタンスP（SP）とその高親和性受容体であるNK-1Rが大腸の炎症時に高発現しています。これまでの研究では、SP/NK-1R シグナルが大腸上皮細胞の増殖を促進することが明らかになっている。本研究では、SP/NK-1R シグナルがエキソソソームバイオジェネシスとエキソソーム-miRNA カーゴソーティングを制御しているかどうかを検討した。さらに、エキソソソーム制御細胞の増殖・遊走における SP/NK-1R シグナルの役割を検討した。NK-1R を過剰発現させたヒト大腸 NCM460 上皮細胞（NCM460-NK1R）が産生するエクソソソームを培地から単離した。エクソソソームの豊富さと取り込みは、ウエスタンブロット分析（豊富さ）とExo-Green蛍光顕微鏡（豊富さと取り込み）で評価した。カーゴ-miRNAレベルはRT-PCRにより評価した。細胞増殖および遊走は、xCELLigence 技術を用いて評価した。大腸上皮エクソソームは、3日間SPで前処理したマウスから単離した。インビボでの細胞増殖は、-67染色により評価した。ヒト大腸上皮細胞（in vitro）およびマウス大腸（in vivo）におけるSP/NK-1Rシグナル伝達は、エキソソソーム産生を増加させ、エキソソソームで処理したNCM460sの蛍光レベルを増加させ、エキソソソームカーゴ中のmiR-21のレベルを増加させた。さらに、SP/NK-1Rによる細胞増殖・遊走は、in vitroおよびin vivoにおいて、エクソソソームのmiR-21を介した細胞間コミュニケーションに少なくとも部分的に依存していることを示した。本研究では、SP/NK-1Rシグナルがエクソソソームの生合成を制御し、そのmiR-21カーゴソーティングを誘導していることを明らかにした。さらに、エクソソソームのmiR-21は標的細胞の増殖・遊走を促進することを明らかにした。サブスタンスPシグナルは、ヒト大腸上皮細胞および野生型マウスの大腸クリプトにおけるエクソソーム産生を制御している。MiR-21はSubstance P刺激によりエクソソームに選択的に選別され、ヒト結腸上皮細胞およびマウス結腸クリプトにおいて細胞増殖および遊走を促進する。

Exosomes are cellular vesicles involved in intercellular communication via their specialized molecular cargo, such as miRNAs. Substance P (SP), a neuropeptide/hormone, and its high-affinity receptor, NK-1R, are highly expressed during colonic inflammation. Our previous studies show that SP/NK-1R signaling stimulates differential miRNA expression and promotes colonic epithelial cell proliferation. In this study, we examined whether SP/NK-1R signaling regulates exosome biogenesis and exosome-miRNA cargo sorting. Moreover, we examined the role of SP/NK-1R signaling in exosome-regulated cell proliferation and migration. Exosomes produced by human colonic NCM460 epithelial cells overexpressing NK-1R (NCM460-NK1R) were isolated from culture media. Exosome abundance and uptake were assessed by Western blot analysis (abundance) and Exo-Green fluorescence microscopy (abundance and uptake). Cargo-miRNA levels were assessed by RT-PCR. Cell proliferation and migration were assessed using xCELLigence technology. Colonic epithelial exosomes were isolated from mice pretreated with SP for 3 days. Cell proliferation in vivo was assessed by -67 staining. SP/NK-1R signaling in human colonic epithelial cells (in vitro) and mouse colons (in vivo) increased ) exosome production, ) the level of fluorescence in NCM460s treated with Exo-Green-labeled exosomes, and ) the level of miR-21 in exosome cargo. Moreover, our results showed that SP/NK-1R-induced cell proliferation and migration are at least in part dependent on intercellular communication via exosomal miR-21 in vitro and in vivo. Our results demonstrate that SP/NK-1R signaling regulates exosome biogenesis and induces its miR-21 cargo sorting. Moreover, exosomal miR-21 promotes proliferation and migration of target cells. Substance P signaling regulates exosome production in human colonic epithelial cells and colonic crypts in wild-type mice. MiR-21 is selectively sorted into exosomes induced by Substance P stimulation and promotes cell proliferation and migration in human colonocytes and mouse colonic crypts.