シロイヌナズナ由来ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの生化学的特性評価（英文

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Biochem. J..2019 10;476(20):2939-2952. BCJ20190523. doi: 10.1042/BCJ20190523.

シロイヌナズナ由来ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの生化学的特性評価（英文

Biochemical characterization of phosphoenolpyruvate carboxykinases from Arabidopsis thaliana.

Bruno E Rojas
Matías D Hartman
Carlos M Figueroa
Laura Leaden
Florencio E Podestá
Alberto A Iglesias

PMID: 31548269 DOI: 10.1042/BCJ20190523.

抄録

C4 および CAM 植物由来の ATP 依存性ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCKs, EC 4.1.1.1.49）は、光合成における CO2 固定に重要な役割を果たしていることから、広く研究されてきた。しかし、C3種由来の酵素の構造、動態、制御特性に関する知見はまだ限られている。本研究では、シロイヌナズナで同定された2つのPEPCKの組換え生産と生化学的特性を報告する。AthPEPCK1とAthPEPCK2である。その結果、両酵素はオキサロ酢酸とATPに対して高い親和性を示し、脱炭酸酵素としての役割を強化していることを明らかにした。我々は、示差走査型蛍光光度法を用いて、アロステリックレギュレーターと考えられる酵素をハイスループットスクリーニングし、酵素動力学を行うことで酵素活性への影響を確認した。AthPEPCK1とAthPEPCK2は、植物代謝の主要な中間体であるコハク酸、フマル酸、クエン酸、α-ケトグルタル酸によってアロステリックに制御されていることがわかった。興味深いことに、リンゴ酸は活性化し、6-リン酸グルコースはAthPEPCK1を阻害したが、AthPEPCK2には影響を及ぼさなかった。以上の結果から、ホスホエノールピルビン酸で構成される重要な代謝節に関与する酵素は、微細なアロステリック制御の標的であることが明らかになった。

ATP-dependent phosphoenolpyruvate carboxykinases (PEPCKs, EC 4.1.1.49) from C4 and CAM plants have been widely studied due to their crucial role in photosynthetic CO2 fixation. However, our knowledge on the structural, kinetic and regulatory properties of the enzymes from C3 species is still limited. In this work, we report the recombinant production and biochemical characterization of two PEPCKs identified in Arabidopsis thaliana: AthPEPCK1 and AthPEPCK2. We found that both enzymes exhibited high affinity for oxaloacetate and ATP, reinforcing their role as decarboxylases. We employed a high-throughput screening for putative allosteric regulators using differential scanning fluorometry and confirmed their effect on enzyme activity by performing enzyme kinetics. AthPEPCK1 and AthPEPCK2 are allosterically modulated by key intermediates of plant metabolism, namely succinate, fumarate, citrate and α-ketoglutarate. Interestingly, malate activated and glucose 6-phosphate inhibited AthPEPCK1 but had no effect on AthPEPCK2. Overall, our results demonstrate that the enzymes involved in the critical metabolic node constituted by phosphoenolpyruvate are targets of fine allosteric regulation.