逆ミセルカプセル化を用いたタンパク質のフラグメントスクリーニングにおける検出限界の拡大

Extending the Detection Limit in Fragment Screening of Proteins Using Reverse Micelle Encapsulation.

• Brian Fuglestad
• Nicole E Kerstetter
• Sabrina Bédard
• A Joshua Wand

抄録

タンパク質と低分子の非常に弱い（10mMを超える）相互作用を検出することは、これまで困難であった。これはフラグメントベースの創薬において特に重要であり、潜在的に有用なフラグメントの大部分は現在のスクリーニング方法では目に見えないと考えられている。本研究では、低親和性領域でのタンパク質-フラグメント相互作用の検出を可能にし、現在の検出限界を約10mMから約200mMまで拡張したNMR法を開発した。逆ミセルカプセル化は、モデルフラグメントをジヒドロ葉酸還元酵素に結合させることで検証されている原理を利用して、非常に高いフラグメント濃度とタンパク質濃度に効果的に到達させます。この方法は、既知のリガンド結合ポケットを持たないインターロイキン-1βに対する小さな極性フラグメントライブラリーの標的検出スクリーニングによって示されています。滴定と構造的背景による結合の評価により、厳密な構造的・統計的基準を用いて、観察されたヒット分子を検証することができます。21個のヒット分子は、ライブラリの約10％という驚異的なヒット率を示しています。解析の結果、フラグメントの結合には、タンパク質表面の3分の2を占める残基が関与していることがわかりました。現在のフラグメントスクリーニング方法は、リガンド結合ポケットへの比較的タイトな結合の検出に依存しています。ここで紹介する方法は、たとえ標的とする領域が比較的平坦な表面によって定義されていたとしても、タンパク質の所望の領域に結合する低分子の開発の出発点を忠実に発見できる可能性を示している。

Detection of very weak ( > 10 mM) interactions of proteins with small molecules has been elusive. This is particularly important for fragment-based drug discovery, where it is suspected that the majority of potentially useful fragments will be invisible to current screening methodologies. We describe an NMR approach that permits detection of protein-fragment interactions in the very low affinity range and extends the current detection limit of ∼10 mM up to ∼200 mM and beyond. Reverse micelle encapsulation is leveraged to effectively reach very high fragment and protein concentrations, a principle that is validated by binding model fragments to dihydrofolate reductase. The method is illustrated by target-detected screening of a small polar fragment library against interleukin-1β, which lacks a known ligand-binding pocket. Evaluation of binding by titration and structural context allows for validation of observed hits using rigorous structural and statistical criteria. The 21 curated hit molecules represent a remarkable hit rate of nearly 10% of the library. Analysis shows that fragment binding involves residues comprising two-thirds of the protein's surface. Current fragment screening methods rely on detection of relatively tight binding to ligand binding pockets. The method presented here illustrates a potential to faithfully discover starting points for development of small molecules that bind to a desired region of the protein, even if the targeted region is defined by a relatively flat surface.