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CTGリピート選択的化学スクリーニングにより、微小管阻害剤が有毒CUG RNAレベルの選択的調節因子として同定された
A CTG repeat-selective chemical screen identifies microtubule inhibitors as selective modulators of toxic CUG RNA levels.
PMID: 31570586 PMCID: PMC6800345. DOI: 10.1073/pnas.1901893116.
抄録
筋緊張性ジストロフィー1型（DM1）の原因となる突然変異は、遺伝子内のCTGリピートの拡大である。拡張したCTGリピートの転写は、毒性のある機能獲得CUG RNAを産生し、疾患症状を引き起こす。有毒なCUG RNAの産生または安定性を選択的に標的とするスクリーニングプラットフォームは、新たな生物学的および治療的知見を提供する可能性を秘めている。DM1 HeLa細胞モデルは、毒性のあるr(CUG)480および類似のr(CUG)0コントロールを安定的に発現し、r(CUG)480対r(CUG)0の比メトリックレベルを測定するために使用された生成されました。このDM1 HeLaモデルは、CUGリボ核病巣、およびマッスルブラインド（MBNL）代替スプライシング因子のプレmRNAターゲットのミスプライシングを含むDM1の病原性の特徴を再現している。この細胞株を用いた反復選択的スクリーニングにより、r(CUG)480レベルを選択的に低下させ、MBNL依存性のミスプライシングを部分的に救済するヒット化合物として、複数の微小管阻害剤が予想外に同定された。これらの結果は、DM1マウスおよび一次患者細胞モデルにおいて、食品医薬品局承認の臨床微小管阻害剤コルヒチンを用いて検証された。作用機序は、CTG拡張の転写を選択的に減少させることに関与していることが判明したが、これはLINC（核骨格と細胞骨格のリンカー）複合体が関与していると仮定している。有毒なCUG RNAの選択的モジュレーターとしての微小管阻害剤の予期せぬ同定は、この形態の筋ジストロフィーの研究の方向性を開き、CTGリピート拡大の生物学に光を当て、治療の道筋を示唆する可能性があります。このアプローチは、30以上のマイクロサテライト拡大障害に対する拡大リピート含有遺伝子発現のモジュレーターを同定する可能性を秘めている。
A CTG repeat expansion in the gene is the causative mutation of myotonic dystrophy type 1 (DM1). Transcription of the expanded CTG repeat produces toxic gain-of-function CUG RNA, leading to disease symptoms. A screening platform that targets production or stability of the toxic CUG RNA in a selective manner has the potential to provide new biological and therapeutic insights. A DM1 HeLa cell model was generated that stably expresses a toxic r(CUG)480 and an analogous r(CUG)0 control from and was used to measure the ratio-metric level of r(CUG)480 versus r(CUG)0. This DM1 HeLa model recapitulates pathogenic hallmarks of DM1, including CUG ribonuclear foci and missplicing of pre-mRNA targets of the muscleblind (MBNL) alternative splicing factors. Repeat-selective screening using this cell line led to the unexpected identification of multiple microtubule inhibitors as hits that selectively reduce r(CUG)480 levels and partially rescue MBNL-dependent missplicing. These results were validated by using the Food and Drug Administration-approved clinical microtubule inhibitor colchicine in DM1 mouse and primary patient cell models. The mechanism of action was found to involve selective reduced transcription of the CTG expansion that we hypothesize to involve the LINC (linker of nucleoskeleton and cytoskeleton) complex. The unanticipated identification of microtubule inhibitors as selective modulators of toxic CUG RNA opens research directions for this form of muscular dystrophy and may shed light on the biology of CTG repeat expansion and inform therapeutic avenues. This approach has the potential to identify modulators of expanded repeat-containing gene expression for over 30 microsatellite expansion disorders.