トリプテリギウム・ウィルフォード由来のモノテルペン合成酵素遺伝子のクローニングと特性評価

[Cloning and characterization of a monoterpene synthase gene from Tripterygium wilfordii].

• Yan Yin
• Si-Yuan Guo
• An-Ya Xiang
• Gui-Lin Li
• Wei Gao
• Xia-Nan Zhang

抄録

Tripterygium wilfordii は、一般的に関節リウマチの治療に使用される薬用植物であり、抗腫瘍や肥満治療の薬理学的活性を持っています。T. wilfordiiに含まれる既知の有効成分は主にテルペノイドであるが、その含有量は非常に少ない。そのため、T. wilfordiiのテルペノイドの生合成経路の解析は、その資源問題を解決するための研究のホットスポットとなっています。テルペノイド合成酵素（TPS）は、多種多様なテルペノイド骨格の形成を触媒する重要な酵素である。本研究では、T. wilfordiiから1,785 bpのORFを持つ遺伝子断片をクローニングした。バイオインフォマティクス解析は、NCBIのBLASTP、ProtParam、InterproのオンラインツールとMEGA 6.0ソフトウェアを用いて行った。また、この遺伝子のジャスモネートメチルに対する応答はリアルタイム蛍光定量PCRにより検出され、その触媒機能は原核生物の発現およびin vitro酵素アッセイにより検証された。バイオインフォマティクス解析の結果、この遺伝子がコードするアミノ酸配列は、TPSのN末端ドメインとC末端ドメインの両方に加え、TPSファミリーのクラスIのDDxx D保存ドメインを有していることが明らかになった。また、Tw MTSはTPS-bサブファミリーとともに、既知の相同なTPSを用いて構築されたNeighbor-Joining Treeに集合していた。さらに、インビトロ酵素反応の結果、Tw MTS は GPP を基質としたβ-シトロネロールの生成を触媒できることが示され、Tw MTS はモノテルペン合成酵素であることが示された。以上の結果は、T. wilfordii テルペノイドの合成生物学データベースに新たな要素を提供し、今後の生合成研究の基礎を築くことができた。

Tripterygium wilfordii is a medicinal plant commonly used in the treatment of rheumatoid arthritis,and with pharmacological activities in anti-tumor and obesity treatment. The known active ingredients in T. wilfordii are mainly terpenoids,but with very low content. Therefore,the analysis of the biosynthesis pathway of terpenoids in T. wilfordii has become a research hotspot to solve the problem of its resources. Terpenoid synthase( TPS) is a key enzyme that catalyzes the formation of a wide variety of terpenoid skeletons. In this study,a gene fragment with an ORF of 1 785 bp was cloned from T. wilfordii. Bioinformatics analysis was performed using NCBI's BLASTP,ProtParam and Interpro online tools and MEGA 6.0 software. The response of this gene to methyl jasmonate was also detected by real-time fluorescent quantitative PCR,and its catalytic function was verified by prokaryotic expression and in vitro enzymatic assay. Bioinformatics analysis indicated that the amino acid sequence encoded by this gene had both N-terminal domain and C-terminal domain of TPS,as well as the DDxx D conserved domain of the class I of TPS family. And Tw MTS gathered together with TPS-b subfamily in the Neighbor-Joining Tree constructed with known homologous TPSs. The results of RT-PCR showed that 50 μmol·L-1 MeJA 12 h could increase the expression of Tw MTS to 735 times in the control group at 12 h,and 1 644 times at 24 h. In addition,in vitro enzymatic reaction results showed that Tw MTS can catalyze the production of β-citronellol with GPP as substrate,indicating that Tw MTS was a monoterpene synthase. The above results provided a new element for the synthetic biology database of T. wilfordii terpenoids,and laid the foundation for future biosynthesis research.