ロドプシンキナーゼGRK1とRecoverinの分子認識は、スイッチングの分子内および分子間静電相互作用によって調整されています

Molecular Recognition of Rhodopsin Kinase GRK1 and Recoverin Is Tuned by Switching Intra- and Intermolecular Electrostatic Interactions.

• Seher Abbas
• Valerio Marino
• Daniele Dell'Orco
• Karl-Wilhelm Koch

抄録

Gタンパク質共役型受容体キナーゼ1（GRK1）またはロドプシンキナーゼは、神経細胞のCaセンサータンパク質recoverinの特異的な制御下にあり、これは桿体細胞の光応答の形状および感度の調節に責任を負う重要なフィードバック機構である。この過程では、相互作用するタンパク質表面の精密なマッチングと、タンパク質構造の動的な変化が必要である。ここでは、リカバリーイン-GRK1複合体におけるカチオン-π相互作用の仮説を検証することにより、リカバリーインとGRK1の分子認識過程を研究している。リカバリーインにおける残基K192の重要な役割を部位特異的変異誘発とその後の構造・機能解析によって調べた。等温滴定熱量測定、蛍光および円二色性分光法、Ca 依存性膜結合、逆散乱干渉法および表面プラズモン共鳴による蛋白質-蛋白質相互作用解析を行った。変異体K192LではKでの電荷を中和してもGRK1へのリカビンの結合は妨げられなかったが、KからEへの電荷を逆にすると相互作用の過程でより多くの歪みが生じたが、どちらの変異もタンパク質のコンフォメーションの安定性を高めた。分子動力学シミュレーションにより、残基 192 はリカバリーインと標的との相互作用の主要な安定化因子ではなく、むしろ野生型リカバリーインではネイティブな K がスイッチングする静電相互作用のネットワークに関与していることが示唆され、これらの知見を説明することができました。

G protein-coupled receptor kinase 1 (GRK1) or rhodopsin kinase is under specific control of the neuronal Ca-sensor protein recoverin, which is a critical feedback mechanism responsible for the modulation of the shape and sensitivity of the rod cell photoresponse. This process requires the precise matching of interacting protein surfaces and the dynamic changes in protein conformations. Here we study the molecular recognition process of recoverin and GRK1 by testing the hypothesis of a cation-π interaction pair in the recoverin-GRK1 complex. The critical role of residue K192 in recoverin was investigated by site-directed mutagenesis and subsequent structural and functional analysis. The following methods were used: isothermal titration calorimetry, fluorescence and circular dichroism spectroscopy, Ca-dependent membrane binding, and protein-protein interaction analysis by back scattering interferometry and surface plasmon resonance. While neutralizing the charge at K in the mutant K192L did not prevent binding of recoverin to GRK1, reversing the charge from K to E led to more distortions in the interaction process, but both mutations increased the stability of the protein conformation. Molecular dynamics simulations provided an explanation for these findings as they let us suggest that residue 192 per se is not a major stabilizer of the interaction between recoverin and its target but rather that the native K is involved in a network of switching electrostatic interactions in wild-type recoverin.