16S rRNAのハイスループットアンプリコンシーケンシングにおける逆転写酵素および条件の効果

The effect of reverse transcription enzymes and conditions on high throughput amplicon sequencing of the 16S rRNA.

• Adam Šťovíček
• Smadar Cohen-Chalamish
• Osnat Gillor

抄録

リボソームの配列決定は、遺伝子をコードするリボソームRNAの配列決定よりも、活発な微生物群集をよりよく反映していると考えられている。しかし、人間の腸内から海洋深部まで、様々な環境下での微生物群集を研究してきた多くの研究では、DNAとRNAをベースとした群集の間に矛盾があることから、このパラダイムの妥当性に疑問を呈してきました。ここでは、解析の鍵となる重要なステップである逆転写（RT）反応に焦点を当てる。これまでの研究では、発現遺伝子やリボソームrRNAを定量する際にRTがバイアスをもたらす可能性があることが示されていたが、微生物の多様性やコミュニティの構成に及ぼす影響については検証されていなかった。リボソームRNAのハイスループットシークエンシングは、DNA分析よりも活動集団をよりよく記述できるため、微生物群集を理解するための貴重なツールである。しかし、RTの必要なステップは、これまでのところ十分に記述されていないバイアスを導入する可能性がある。本原稿では、土壌微生物学で一般的に使用されている3つのRT酵素を2つの温度モードで比較し、非標準化されたRT条件に起因するバイアスの潜在的な原因を明らかにする。我々の比較では、細菌クラスの豊富さにおいて最大6倍の差が観察された。温度によって誘発されるバイアスは、影響を受けた細菌群の G-C 含有量によって部分的に説明でき、したがって、より高い反応温度の必要性を示唆しています。しかし、別のバイアスの原因は、酵素のプロセス性の違いによるものでした。このバイアスは克服するのが難しい可能性があり、それを緩和するためには、研究間の比較のために1つの酵素を使用する必要があるかもしれません。

It is assumed that the sequencing of ribosomes better reflects the active microbial community than the sequencing of the ribosomal RNA encoding genes. Yet, many studies exploring microbial communities in various environments, ranging from the human gut to deep oceans, questioned the validity of this paradigm due to the discrepancies between the DNA and RNA based communities. Here, we focus on an often neglected key step in the analysis, the reverse transcription (RT) reaction. Previous studies showed that RT may introduce biases when expressed genes and ribosmal rRNA are quantified, yet its effect on microbial diversity and community composition was never tested. High throughput sequencing of ribosomal RNA is a valuable tool to understand microbial communities as it better describes the active population than DNA analysis. However, the necessary step of RT may introduce biases that have so far been poorly described. In this manuscript, we compare three RT enzymes, commonly used in soil microbiology, in two temperature modes to determine a potential source of bias due to non-standardized RT conditions. In our comparisons, we have observed up to six fold differences in bacterial class abundance. A temperature induced bias can be partially explained by G-C content of the affected bacterial groups, thus pointing toward a need for higher reaction temperatures. However, another source of bias was due to enzyme processivity differences. This bias is potentially hard to overcome and thus mitigating it might require the use of one enzyme for the sake of cross-study comparison.

© 2019 Šťovíček et al.