EPR分光法によるヒト40Sリボソームサブユニットと短鎖RNAの相互作用の解明

Exploring the interactions of short RNAs with the human 40S ribosomal subunit near the mRNA entry site by EPR spectroscopy.

• Alexey A Malygin
• Olesya A Krumkacheva
• Dmitri M Graifer
• Ivan O Timofeev
• Anastasia S Ochkasova
• Maria I Meschaninova
• Alya G Venyaminova
• Matvey V Fedin
• Michael Bowman
• Galina G Karpova
• Elena G Bagryanskaya

抄録

ヒト40SリボソームサブユニットのRNAとのラビレ複合体の特徴をEPR分光法で調べた。この複合体は、RNAのアルデヒド誘導体がリボソームタンパク質であるuS3とmRNAチャネルの外側にあるペプチド55-64を介して架橋することで形成される。サブアトミック40Sサブユニットモデルの解析により、ラビレ性RNAの結合部位は、mRNA入口部位とuS3ペプチド55-64の間にある正に帯電したアミノ酸残基のクラスターである可能性が示された。これは、40Sサブユニットの外側にぶら下がっている3'末端mRNAフラグメントが、このペプチドへのRNA誘導体の架橋を妨げるという我々の発見と一致している。DEER/PELDOR 分光法で 40S サブユニットの RNA とのラビレ複合体を検出するために、末端ヌクレオチドにニトロキシド スピンラベルを持つウンデカリボヌクレオチド誘導体を利用しました。40SサブユニットチャネルのmRNAとの占有率はRNA誘導体の結合に影響を与えず、また、uS3ペプチド55-64は結合相互作用に関与しないことを実証した。RNA誘導体をDNA誘導体に置き換えることで、リボース2'-OH基が複合体形成に重要であることを明らかにした。単一ラベルのRNA誘導体を用いて、40Sサブユニット上のmRNAエントリーサイトと緩く結合したRNAサイトの間の距離を推定した。

The features of previously unexplored labile complexes of human 40S ribosomal subunits with RNAs, whose formation is manifested in the cross-linking of aldehyde derivatives of RNAs to the ribosomal protein uS3 through its peptide 55-64 located outside the mRNA channel, were studied by EPR spectroscopy methods. Analysis of subatomic 40S subunit models showed that a likely site for labile RNA binding is a cluster of positively charged amino acid residues between the mRNA entry site and uS3 peptide 55-64. This is consistent with our finding that the 3'-terminal mRNA fragment hanging outside the 40S subunit prevents the cross-linking of an RNA derivative to this peptide. To detect labile complexes of 40S subunits with RNA by DEER/PELDOR spectroscopy, an undecaribonucleotide derivative with nitroxide spin labels at terminal nucleotides was utilized. We demonstrated that the 40S subunit channel occupancy with mRNA does not affect the RNA derivative binding and that uS3 peptide 55-64 is not involved in binding interactions. Replacing the RNA derivative with a DNA one revealed the importance of ribose 2'-OH groups for the complex formation. Using the single-label RNA derivatives, the distance between the mRNA entry site and the loosely bound RNA site on the 40S subunit was estimated.

© The Author(s) 2019. Published by Oxford University Press on behalf of Nucleic Acids Research.