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ヒト顆粒膜細胞における抗ミューレリアンホルモンの調節とシグナル伝達：多嚢胞性卵巣症候群との関連性
The regulation and signalling of anti-Müllerian hormone in human granulosa cells: relevance to polycystic ovary syndrome.
PMID: 31735954 DOI: 10.1093/humrep/dez214.
抄録
研究の質問:
多嚢胞性卵巣症候群（PCOS）における抗ミューレリアンホルモン（AMH）レベルの低下を防ぐものは何ですか？
STUDY QUESTION: What prevents the fall in anti-Müllerian hormone (AMH) levels in polycystic ovary syndrome (PCOS) and what are the consequences of this for follicle progression in these ovaries?
サマリー回答:
顆粒膜細胞（GC）をPCOSで見られるのと同等の高レベルのアンドロゲンに曝露すると、AMHの低下を防ぎ、PCOSの卵胞進行を停滞させるAMH-SMADシグナリングの制御異常と関連していました。
SUMMARY ANSWER: Exposure of granulosa cells (GCs) to high levels of androgens, equivalent to that found in PCOS, prevented the fall in AMH and was associated with dysregulated AMH-SMAD signalling leading to stalled follicle progression in PCOS.
すでに知られていること:
正常な卵巣では、AMHは卵胞の発育を抑制する役割を果たしており、AMHレベルの低下は排卵の前提条件となっています。PCOSではAMHのレベルが高く、このような女性の排卵誘発性不妊の一般的な原因である卵胞成長の異常に寄与しています。
WHAT IS KNOWN ALREADY: In normal ovaries, AMH exerts an inhibitory role on antral follicle development and a fall in AMH levels is a prerequisite for ovulation. Levels of AMH are high in PCOS, contributing to the dysregulated follicle growth that is a common cause of anovulatory infertility in these women.
デザイン、サイズ、期間:
ヒトKGN-GC（小さな肛門濾胞（AF）からの未成熟GCに対応する細胞株）を、AMH産生への影響を決定するために、様々なアンドロゲンの投与量の範囲で培養しました。また、KGN-GCをPHTPP（エストロゲン受容体β（ERβ）アンタゴニスト）で処理し、AMH発現とERα：ERβの比率との関係を調べた。正常卵巣の女性、多嚢胞性卵巣形態（PCOM）の女性、PCOSの女性から採取したヒト肉芽膜-黄体細胞（hGLC）を用いて、遺伝子発現とSMADシグナル伝達に対するAMHの用量相関効果を調べた。KGN-GCはまた、細胞増殖と生存率への影響を評価するために、異なる用量のAMHで長期間培養されました。
STUDY DESIGN, SIZE, DURATION: Human KGN-GC (the cell line that corresponds to immature GC from smaller antral follicles (AF)) were cultured with a range of doses of various androgens to determine the effects on AMH production. KGN-GC were also treated with PHTPP (an oestrogen receptor β (ERβ) antagonist) to examine the relationship between AMH expression and the ratio of ERα:ERβ. The differential dose-related effect of AMH on gene expression and SMAD signalling was investigated in human granulosa-luteal cells (hGLC) from women with normal ovaries, with polycystic ovarian morphology (PCOM) and with PCOS. KGN-GC were also cultured for a prolonged period with AMH at different doses to assess the effect on cell proliferation and viability.
参加者/材料、設定、方法:
アンドロゲンに曝露された細胞による AMH タンパク質産生を ELISA 法で測定した。AMH、ERαおよびERβのmRNA発現レベルに対するPHTPPの影響をリアルタイム定量PCR（qPCR）により評価した。コントロール、PCOM 及び PCOS hGLCs におけるアロマターゼ、AMH 及びその受容体 AMHRII、FSH 及び LH 受容体（FSHR 及び LHR）の相対的な mRNA 発現レベルに対する AMH の影響を qPCR により定量化した。健康な女性およびPCOSの女性のhGLCをAMHに曝露した後のSMADタンパク質（pSMAD-1/5/8；SMAD-4；SMAD-6およびSMAD-7）のレベルの変化を評価するためにウエスタンブロットを使用した。ApoTox-Glo Triplexアッセイを用いて、細胞生存率、細胞毒性、アポトーシスに対するAMHの効果を評価した。
PARTICIPANTS/MATERIALS, SETTING, METHODS: AMH protein production by cells exposed to androgens was measured by ELISA. The effect of PHTPP on the mRNA expression levels of AMH, ERα and ERβ was assessed by real-time quantitative PCR (qPCR). The influence of AMH on the relative mRNA expression levels of aromatase, AMH and its receptor AMHRII, and the FSH and LH receptor (FSHR and LHR) in control, PCOM and PCOS hGLCs was quantified by qPCR. Western blotting was used to assess changes in levels of SMAD proteins (pSMAD-1/5/8; SMAD-4; SMAD-6 and SMAD-7) after exposure of hGLCs from healthy women and women with PCOS to AMH. The ApoTox-Glo Triplex assay was used to evaluate the effect of AMH on cell viability, cytotoxicity and apoptosis.
主な結果とチャンスの役割:
テストステロンは10-9-10-7MでKGN-GCから分泌されるAMHタンパク質を減少させた（P<0.05; P<0.005、複数の無補正比較 フィッシャーズ最小二乗差）が、同等の高アンドロゲン血症レベルではAMHレベルに変化は見られなかった。5α-DHTは、媒体中に分泌されるAMHタンパク質の用量に関連した有意な増加をもたらした（P=0.022、ANOVA）。ERα:ERβのmRNA比を増加させると、AMHのmRNA発現が増加した（P=0.015、双方向ANOVA）。AMHは、PCOM女性由来のhGLCにおいてアロマターゼ（P<0.05、一方通行ANOVA）とFSHR（P<0.0001、一方通行ANOVA）のmRNAレベルを増加させたが、正常細胞やPCOS（正常n=7、PCOMn=5、PCOSn=4）からは増加させなかった。排卵卵巣由来のhGLCとは対照的に、PCOSでは、AMHは刺激性のpSMAD-1/5/8およびSMAD-4のタンパク質レベル（細胞内容）を減少させたが、抑制性のSMAD-6および-7を増加させた（P<0.05、正常n=6、PCOS n=3）。20および50ng/mlのAMHは、治療8日後にKGN-GC細胞の増殖を減少させたが、生存率は減少しなかった（P<0.005、双方向ANOVA）。
MAIN RESULTS AND THE ROLE OF CHANCE: Testosterone reduced AMH protein secreted from KGN-GC at 10-9-10-7 M (P < 0.05; P < 0.005, multiple uncorrected comparisons Fishers least squares difference), but at equivalent hyperandrogenemic levels no change was seen in AMH levels. 5α-DHT produced a significant dose-related increase in AMH protein secreted into the media (P = 0.022, ANOVA). Increasing the mRNA ratio of ERα:ERβ produced a corresponding increase in AMH mRNA expression (P = 0.015, two-way ANOVA). AMH increased mRNA levels of aromatase (P < 0.05, one-way ANOVA) and FSHR (P < 0.0001, one-way ANOVA) in hGLCs from women with PCOM, but not from normal cells or PCOS (normal n = 7, PCOM n = 5, PCOS n = 4). In contrast to hGLCs from ovulatory ovaries, in PCOS AMH reduced protein levels (cell content) of stimulatory pSMAD-1/5/8 and SMAD-4 but increased inhibitory SMAD-6 and -7 (P < 0.05, normal n = 6, PCOS n = 3). AMH at 20 and 50 ng/ml decreased KGN-GC cell proliferation but not viability after 8 days of treatment (P < 0.005, two-way ANOVA).
大規模データ:
該当なし。
LARGE SCALE DATA: N/A.
限界、注意の理由:
体外受精を受けている女性から採取した黄体化GCは、AMH/AMHRIIの発現は比較的低いですが、採取した卵巣形態に固有の反応を示し続けています。それを補うために、私たちはまた、未熟なGCのそれに近い発達段階にあることが特徴づけられているKGN細胞株を利用しました。テストステロン効果に対するフルタミドの影響の欠如は、それ自体がAMHへの効果がエストロゲンへの変換を介して媒介されていると結論づけるのに十分な証拠ではありませんし、アロマターゼ阻害剤またはエストロゲン特異的阻害剤の効果をテストする必要があります。フルタミドの効果はテストステロンに対して試験されたが、DHTに対しては試験されなかった。
LIMITATIONS, REASONS FOR CAUTION: Luteinised GC from women undergoing IVF have a relatively low expression of AMH/AMHRII but advantageously continue to display responses inherent to the ovarian morphology from which they are collected. To compensate, we also utilised the KGN cell line which has been characterised to be at a developmental stage close to that of immature GC. The lack of flutamide influence on testosterone effects is not in itself sufficient evidence to conclude that the effect on AMH is mediated via conversion to oestrogen, and the effect of aromatase inhibitors or oestrogen-specific inhibitors should be tested. The effect of flutamide was tested on testosterone but not DHT.
調査結果のより広い意味での影響:
正常な卵胞形成と排卵は、卵胞選択時に GC からの AMH 産生がタイムリーに減少するかどうかに依存している。我々の発見は、このモデルではtheca由来のアンドロゲンが役割を果たしている可能性があるが、この抑制作用はPCOSで見られるものと同等のレベルのアンドロゲンでは失われることを初めて明らかにした。AMHの低下は、アンドロゲンの直接的な影響か、エストラジオールへの変換とAMHプロモーターを刺激することが知られているERαのアップレギュレーションを介して作用する間接的な影響のいずれかである可能性があります。興味深いことに、この継続的に上昇するAMHレベルに応答するGCの能力は、SMADシグナル伝達経路の適応的な変化とAMHRIIの低発現のために、PCOSの女性の細胞では減少しているように見え、「AMH抵抗性」の一形態を示しています。
WIDER IMPLICATIONS OF THE FINDINGS: Normal folliculogenesis and ovulation are dependent on the timely reduction in AMH production from GC at the time of follicle selection. Our findings reveal for the first time that theca-derived androgens may play a role in this model but that this inhibitory action is lost at levels of androgens equivalent to those seen in PCOS. The AMH decline may either be a direct effect of androgens or an indirect one via conversion to oestradiol and acting through the upregulation of ERα, which is known to stimulate the AMH promoter. Interestingly, the ability of GCs to respond to this continually elevated AMH level appears to be reduced in cells from women with PCOS due to an adaptive alteration in the SMAD signalling pathway and lower expression of AMHRII, indicating a form of 'AMH resistance'.
研究資金/利益を得るための関心事:
この研究は、セントジョルジュ病院トラストのThomas Addison奨学金から資金提供を受けた。著者らは、この研究における利益相反を報告しておらず、開示すべきことは何もありません。
STUDY FUNDING/COMPETING INTEREST(S): This study was funded by the Thomas Addison Scholarship, St Georges Hospital Trust. The authors report no conflict of interest in this work and have nothing to disclose.
トライアル登録番号:
該当なし。
TRIAL REGISTRATION NUMBER: N/A.
© The Author(s) 2019. Published by Oxford University Press on behalf of the European Society of Human Reproduction and Embryology. All rights reserved. For permissions, please e-mail: journals.permissions@oup.com.