Bostrychus sinensis (Family: Eleotridae)由来のグース型リゾチーム遺伝子の分子クローニング、発現解析、機能解析

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Fish Shellfish Immunol..2020 Jan;96:41-52. S1050-4648(19)31110-6. doi: 10.1016/j.fsi.2019.11.067.Epub 2019-11-30.

Bostrychus sinensis (Family: Eleotridae)由来のグース型リゾチーム遺伝子の分子クローニング、発現解析、機能解析

Molecular cloning, expression analyses and functional characterization of a goose-type lysozyme gene from Bostrychus sinensis (family: Eleotridae).

Ke Wei
Yuehan Ding
Xiaolong Yin
Jianshe Zhang
Bin Shen

PMID: 31794842 DOI: 10.1016/j.fsi.2019.11.067.

抄録

本研究では、中国産クロヤマドリ（Bostrychus sinensis）由来のガチョウ型リゾチーム遺伝子（BsLysG）の塩基配列を決定し、その特徴を明らかにした。BsLysGは196アミノ酸をコードし、可溶性細菌性リゾチームのトランスグリコシラーゼドメイン、3つの触媒残基（Glu、Asp、Asp）、GLMQモチーフ（Gly、Leu、Met、Gln）を含んでいた。BsLysGタンパク質にはシグナルペプチドは観察されなかった。BsLysGのゲノムDNAは5つのエクソンと4つのイントロンを含む。配列解析の結果、BsLysGは他の魚類のLysGと高い類似性を示した。系統解析の結果、BsLysGは他のテレポスト魚類のLysGとよく似ていることが明らかになった。リアルタイムPCR解析の結果、BsLysGは中国産ブラックスリーパーの10の臓器でユビキタスに発現しており、脾臓、腎臓、末梢血の順に発現していることがわかった。発現解析の結果、末梢血、頭腎臓、肝臓、脾臓では、腸炎ビブリオ感染またはポリ（I:C）チャレンジ後にBsLysGがin vivoで有意に発現量が増加した。精製された組換えBsLysG（rBsLysG）は、35℃およびpH5.5で最適な活性を示した。グラム陽性菌2種（Micrococcus lysodeikticus、Staphylococcus aureus）とグラム陰性菌2種（Escherichia coli、V. parahemolyticus）に対して抗菌活性を示した。走査型電子顕微鏡(SEM)画像解析の結果、rBsLysG処理した腸炎菌の細胞は形態学的に変形していることが明らかになった。これらの結果は、BsLysGが細菌感染に対する宿主免疫防御に関与していることを示している。

In this study, we sequenced and characterized the goose-type lysozyme gene, termed as BsLysG, from the Chinese black sleeper (Bostrychus sinensis). The BsLysG encodes 196 amino acids and contains a soluble bacterial lytic transglycosylases domain, three catalytic residues (Glu, Asp and Asp) and the GLMQ motif (Gly, Leu, Met and Gln). No signal peptide was observed in the BsLysG protein. The genomic DNA of BsLysG contains five exons and four introns. The sequence analyses showed that the BsLysG exhibits high similarity with LysG from other fishes. Phylogenetic analyses showed that the BsLysG is clustered together with its counterparts from other teleost fishes. The Real-time PCR analyses showed that the BsLysG was found to be ubiquitously expressed in ten examined organs in Chinese black sleeper, with predominant expression in spleen, followed by head kidney and peripheral blood. Expression analyses showed that the BsLysG was significantly upregulated in vivo after either pathogen Vibrio parahemolyticus infection or poly (I:C) challenge in peripheral blood, head kidney, liver and spleen organs. The purified recombinant BsLysG (rBsLysG) has optimal activity at 35 °C and pH 5.5. The rBsLysG exhibited antimicrobial activity against two Gram-positive bacteria (Micrococcus lysodeikticus and Staphylococcus aureus) and two Gram-negative bacteria (Escherichia coli and V. parahemolyticus). The Scanning electron microscope (SEM) imaging analyses showed that the rBsLysG-treated V. parahemolyticus cells displayed morphological deformation. These results indicate that the BsLysG is involved in host immune defense against bacterial infection.