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ピペリジン誘導体によるヒトリンパ系フィラリア寄生虫のインビトロアポトーシス効果とチミジン反転試験
In vitro apoptotic effect on human lymphatic filarial parasite by piperidine derivatives and thymidine reversal study.
PMID: 31807868 DOI: 10.1007/s00436-019-06492-7.
抄録
新規な合成ピペリジン誘導体のライブラリーを用いて、ヒトリンパ系フィラリア寄生虫Brugia malayiに対するスクリーニングを行った。ピペリジンは，げっ歯類のフィラリア原虫を含む寄生虫に対して効果があることが報告されている。水酸基置換基を有する化合物（4Qおよび4H）は，顕著な抗フィラリア効果を示した。4H誘導体の分子ドッキングにより，B. malayiのチミジル酸合成酵素に対する熱力学的パラメータがヒトよりも優れていることが示された。また，ICとLDの間に大きな差があることから，本候補化合物はフィラリア寄生虫に対する治療上の安全性を保証するものであると考えられた。また，チミジンを添加することにより，4Hの抗フィラリア効果は大きく逆転し，チミジル酸合成酵素の阻害が薬理学的根拠となっていることが確認された。チミジル酸合成酵素の阻害の結果として寄生虫に誘導されるアポトーシスをアクリジンオレンジ/臭化エチジウム蛍光染色およびポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ活性阻害により検討した。その結果、4H 処理したミクロフィラリアでは、未処理のミクロフィラリアと比較して、3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）変換が減少し、シトソリックシトクロム c レベルが増加することから、ミトコンドリアの関与が確認された。さらに，ジヒドロ葉酸還元酵素を標的としたカルコンとチミジル酸合成酵素を標的としたピペリジンのマイケルアダクトは寄生虫に対して相乗効果を示し，複合的な効果によるDNA合成阻害の重要性が示唆された。以上のことから，水酸基置換を有するピペリジン誘導体は，寄生虫のチミジル酸合成酵素を阻害する可能性があることから，ミトコンドリア経路に関与するアポトーシス作用を有し，大きな治療効果が期待できると考えられた。
A novel library of synthetic piperidine derivatives was used to screen against human lymphatic filarial parasite Brugia malayi. Piperidine has earlier been reported to have effect against parasites including rodent filarial nematodes. Compounds with hydroxyl substitutions (4Q and 4H) showed marked antifilarial effect. Molecular docking of 4H derivative showed more favorable thermodynamic parameters against thymidylate synthase of B. malayi than human counterpart. A wide difference between IC and LD ensured the therapeutic safety of the candidates against the filarial parasites. Addition of thymidine to the treatment regimen led to a significant reversal of antifilarial effect of 4H that confirmed inhibition of thymidylate synthase as pharmacological rationale. Apoptosis induced in the parasite as a consequence of probable inhibition of thymidylate synthase was studied by acridine orange/ethidium bromide fluorescent staining and poly (ADP-ribose) polymerase activity inhibition. Involvement of mitochondria was confirmed by decreased 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT) conversion and increased cytosolic cytochrome c level in 4H treated microfilariae, compared with the untreated microfilariae. Moreover, Michael adduct of chalcone targeting dihydrofolate reductase and piperidine targeting thymidylate synthase demonstrated synergistic effect on the parasite, indicating the importance of inhibition of DNA synthesis by combined effect. In conclusion, piperidine derivatives with hydroxyl substitution have a great therapeutic potential with an apoptotic rationale involving mitochondrial pathway, due to possible inhibition of parasitic thymidylate synthase.