硝酸還元酵素遺伝子napCの自発的な変異は、異なる気候の地域で環境に優しい低NOを放出するアルファルファ根粒菌の出現を駆動する

Spontaneous Mutations in the Nitrate Reductase Gene napC Drive the Emergence of Eco-friendly Low-NO-Emitting Alfalfa Rhizobia in Regions with Different Climates.

• Silvina Brambilla
• Gabriela Soto
• Ariel Odorizzi
• Valeria Arolfo
• Wayne McCormick
• Emiliano Primo
• Walter Giordano
• Cintia Jozefkowicz
• Nicolás Ayub

抄録

我々は最近、脱窒剤モデル株Sinorhizobium meliloti 1021と密接に関連する市販のアルファルファ接種剤（例えば、Sinorhizobium meliloti B399）は、硝酸塩から温室効果ガスである一酸化窒素（NO）の生産に関連する硝酸塩、亜硝酸塩、一酸化窒素還元酵素を保存しているが、NOのガス窒素への分解に関連するNO還元酵素を失っていることを示した。ここで、我々は、異なる生態系に由来し、NO還元酵素遺伝子を含む窒素固定アルファルファ共生体のライブラリをスクリーニングし、例外的に低いNO排出量を示す新規な根粒菌（Sinorhizobium meliloti INTA1-6）を同定した。この環境に優しい表現型の遺伝的基盤を解明するために、脱窒遺伝子に着目してゲノム解析を行ったところ、硝酸還元酵素構造遺伝子napCにのみ変異が認められた。進化解析の結果、これらの自然株では、脱窒遺伝子は垂直移入により遺伝し、その欠損した硝酸還元酵素napC対立遺伝子は独立した自然変異により出現したことが明らかになった。インシリコ解析の結果、この遺伝子の変異は負の自由エネルギー（-ΔG）の高いssDNAループ構造で発生し、その結果、変異したステムループ構造は安定性が向上し、転写に関連した変異イベントの発生を示唆していることが示された。これらの ssDNA サイトの少なくとも 1 つが脱窒条件下での突然変異のホットスポットであることが、インビボでのアッセイによって裏付けられた。窒素固定からの同様の利益は、植物を市販の接種剤B399および株INTA4-6で接種した場合に観察され、低NO放出根粒菌は、経済的な収益性を諦めることなく、現在の接種剤の生態学的な代替品となり得ることを示唆している。

We have recently shown that commercial alfalfa inoculants (e.g., Sinorhizobium meliloti B399), which are closely related to the denitrifier model strain Sinorhizobium meliloti 1021, have conserved nitrate, nitrite, and nitric oxide reductases associated with the production of the greenhouse gas nitrous oxide (NO) from nitrate but lost the NO reductase related to the degradation of NO to gas nitrogen. Here, we screened a library of nitrogen-fixing alfalfa symbionts originating from different ecoregions and containing NO reductase genes and identified novel rhizobia (Sinorhizobium meliloti INTA1-6) exhibiting exceptionally low NO emissions. To understand the genetic basis of this novel eco-friendly phenotype, we sequenced and analyzed the genomes of these strains, focusing on their denitrification genes, and found mutations only in the nitrate reductase structural gene napC. The evolutionary analysis supported that, in these natural strains, the denitrification genes were inherited by vertical transfer and that their defective nitrate reductase napC alleles emerged by independent spontaneous mutations. In silico analyses showed that mutations in this gene occurred in ssDNA loop structures with high negative free energy (-ΔG) and that the resulting mutated stem-loop structures exhibited increased stability, suggesting the occurrence of transcription-associated mutation events. In vivo assays supported that at least one of these ssDNA sites is a mutational hot spot under denitrification conditions. Similar benefits from nitrogen fixation were observed when plants were inoculated with the commercial inoculant B399 and strains INTA4-6, suggesting that the low-NO-emitting rhizobia can be an ecological alternative to the current inoculants without resigning economic profitability.