細菌の遺伝子駆動システムは、高コピー数の抗生物質耐性遺伝子座を効率的に編集し、不活性化する

A bacterial gene-drive system efficiently edits and inactivates a high copy number antibiotic resistance locus.

• J Andrés Valderrama
• Surashree S Kulkarni
• Victor Nizet
• Ethan Bier

抄録

二倍体の遺伝子駆動システムでは、ある対立遺伝子が別の対立遺伝子よりも優先して遺伝することに偏りがある。CRISPR ベースのゲノムドライブは、ガイド RNA (gRNA) を、GRNA が Cas9 を媒介する切断を指示する部位でゲノムに発現させる。Cas9 の存在下では、gRNA カセットと連結されたカーゴ配列は、相同染色体上に相同修復（HDR）を介してコピーされます。ここで、我々は、大腸菌のための類似のCRISPRベースの遺伝子駆動システムを開発しました。これは、標的とするgRNA/Cas9切断部位に相同な配列を持つgRNAカセットと隣接するカーゴを効率的にコピーします。この「プロアクティブ」遺伝子システム（Pro-AG）は、高コピー数プラスミド上の抗生物質耐性マーカーを、対照のCRISPRベースの方法と比較して100倍以上の効率で機能的に不活性化します。Pro-AGは、大型プラスミドやシングルコピーのゲノムターゲットを効果的に編集したり、機能的な遺伝子を導入したりすることができ、バイオテクノロジーやバイオメディシンへの応用の可能性を示唆しています。

Gene-drive systems in diploid organisms bias the inheritance of one allele over another. CRISPR-based gene-drive expresses a guide RNA (gRNA) into the genome at the site where the gRNA directs Cas9-mediated cleavage. In the presence of Cas9, the gRNA cassette and any linked cargo sequences are copied via homology-directed repair (HDR) onto the homologous chromosome. Here, we develop an analogous CRISPR-based gene-drive system for the bacterium Escherichia coli that efficiently copies a gRNA cassette and adjacent cargo flanked with sequences homologous to the targeted gRNA/Cas9 cleavage site. This "pro-active" genetic system (Pro-AG) functionally inactivates an antibiotic resistance marker on a high copy number plasmid with ~ 100-fold greater efficiency than control CRISPR-based methods, suggesting an amplifying positive feedback loop due to increasing gRNA dosage. Pro-AG can likewise effectively edit large plasmids or single-copy genomic targets or introduce functional genes, foreshadowing potential applications to biotechnology or biomedicine.