太平洋産カキ Crassostrea gigas の新規腫瘍壊死因子は、リゾチームと一酸化窒素の合成を誘発することで抗菌反応を媒介している

A novel tumor necrosis factor in the Pacific oyster Crassostrea gigas mediates the antibacterial response by triggering the synthesis of lysozyme and nitric oxide.

• Yan Zheng
• Zhaoqun Liu
• Lingling Wang
• Meijia Li
• Yukun Zhang
• Yanan Zong
• Yinan Li
• Linsheng Song

抄録

腫瘍壊死因子（TNF）は、様々な病理学的・免疫学的プロセスに関与する多機能性炎症性サイトカインの一群である。最近、軟体動物からいくつかの原始的なTNFが同定され、細胞のアポトーシス、貪食、免疫関連酵素の産生などの調節に重要な役割を果たしている。本研究では、カキCrassostrea gigasから抗菌応答を媒介する活性を持つ新規TNF(CgTNF-2)を同定した。CgTNF-2のオープンリーディングフレームは783bpで、典型的なTNFドメインを持つ261アミノ酸のポリペプチドをコードしていた。CgTNF-2のアミノ酸配列は、これまでに他の軟体動物から同定されたTNFのアミノ酸配列と高い同一性を共有しており、例えば、カキC. hongkongensisの96.1％の同一性、ホタテ貝のMizuhopecten yessoensisの33.7％の同一性、カキC. gigasのCgTNF-1の33.0％の同一性などであった。系統樹の中には脊椎動物と無脊椎動物の2つの異なるTNF分岐があり、CgTNF-2はまずC. hongkongensis由来のTNF-14とクラスタリングされ、その後他の軟体動物のTNFとクラスタリングされた。CgTNF-2のmRNA転写物は、様々なカキの組織で広く発現しており、血球での発現が最も高かった。CgTNF-2の発現量は、ペプチドグリカン及びリポ多糖処理後6hで有意に増加し（それぞれ2.45倍及び6.20倍、p＜0.05）、12hでピークを迎えた（それぞれ31.86倍及び7.90倍、p＜0.05）。CgTNF-2の組換えタンパク質(rCgTNF-2)は、800ng/mLの濃度でヒト歯槽基底上皮(A549)細胞の増殖を阻害した。また、カキにrCgTNF-2を注射した後のカキの血清は、対照群に比べて有意に高い抗菌活性を示し、ビブリオ・スプレンディッドゥス菌の増殖を抑制した。また、カキ血清中のリゾチーム活性や一酸化窒素含量も有意に増加した。以上の結果から、CgTNF-2は二枚貝のTNF-αファミリーの新規メンバーであり、カキの自然免疫応答においてリゾチーム活性と一酸化窒素産生を誘導することで抗菌活性を誘導する可能性があることが示唆された。

Tumor necrosis factors (TNFs) are a group of multifunctional inflammatory cytokines involved in various pathological and immune processes. Recently, a few primitive TNFs have been characterized from molluscs, which play important roles in modulating cell apoptosis, phagocytosis and production of immune-related enzymes. In the present study, a novel TNF (named as CgTNF-2) with the activity to mediate antibacterial response was identified from the Pacific oyster Crassostrea gigas. The open reading frame of CgTNF-2 was of 783 bp encoding a putative polypeptide of 261 amino acids with a typical TNF domain. The deduced amino acid sequence of CgTNF-2 shared high identity with that of TNFs previously identified from other molluscs, such as 96.1% identity with that in oyster C. hongkongensis, 33.7% identity with that in scallop Mizuhopecten yessoensis and 33.0% identity with CgTNF-1 in oyster C. gigas. There were two distinct TNF branches of vertebrate and invertebrate in the phylogenetic tree, and CgTNF-2 was firstly clustered with TNF-14 from C. hongkongensis, and then clustered with other molluscan TNFs. The mRNA transcripts of CgTNF-2 were widely expressed in various oyster tissues, with the highest expression level in hemocytes. The expression level of CgTNF-2 increased significantly at 6 h (2.45-fold and 6.20-fold, respectively, p < 0.05) after peptidoglycan and lipopolysaccharides treatments, and peaked at 12 h (31.86-fold and 7.90-fold, respectively, p < 0.05). The recombinant protein of CgTNF-2 (rCgTNF-2) inhibited the growth of human alveolar basal epithelial (A549) cells at a concentration of 800 ng/mL. After the oysters received an injection of rCgTNF-2, the serum from those oysters exhibited significantly higher antibacterial activity compared to that from control group, evidenced by inhibiting the growth of Vibrio splendidus. Moreover, the lysozyme activity as well as the contents of nitric oxide in the oyster serum also increased significantly. The above results collectively suggested that CgTNF-2 was a novel member of bivalve TNF-α family, which could prompt the antibacterial activity by inducing the lysozyme activity and the production of nitric oxide in the innate immune response of oyster.

Copyright © 2019. Published by Elsevier Ltd.