プロ/N-デグロン経路の基質と構成要素の進化

Evolution of Substrates and Components of the Pro/N-Degron Pathway.

• Shun-Jia Chen
• Artem Melnykov
• Alexander Varshavsky

抄録

ユビキチンリガーゼGIDのサブユニットであるGid4は、Pro/N-デグロン経路の認識成分である。Gid4は、特に、それらのN末端（Nt）プロリン（Pro）残基を介してタンパク質を標的とする。酵母や他の酵母では、グルコネ酵素Fbp1、Icl1、Mdh2がNt-Proを担い、Pro/N-デグロン経路によって条件付きで破壊されている。しかし、哺乳類や酵母以外の多くの酵素では、これらの酵素は Nt-Pro を欠いている。私たちは、Pro/N-デグロン経路の進化を探るために利用しました。Fbp1, Icl1, Mdh2における非Pro Nt残基の存在は、進化の時間スケール（約1億5千万年前に発散した）において、Gid4 N-recogninの特異性の変化を伴っていたのかどうかを調べた。酵母ベースの２ハイブリッ ド結合アッセイとタンパク質分解アッセイを用いて、Fbp1 の非プロ(Ala)Nt 残基がこの酵素を長生きさせることを示した。また、Nt-AlaとFbp1の次の3つの残基をFbp1の4残基のNt-PTLV配列で置換することで、結果として得られる"ハイブリッド"Fbp1がGid4の短命な基質となることを発見した。我々は、これらの結果と関連する結果を説明するために、準中立的な遺伝的ドリフトと自然淘汰のブレンドを考慮しています。私たちの知る限りでは、この研究は、この生物での使用に適した最初のタンパク質分解アッセイ（抗生物質ブラスチジンに基づく）の開発を含む、 .のユビキチンシステムの最初の研究である。

Gid4, a subunit of the ubiquitin ligase GID, is the recognition component of the Pro/N-degron pathway. Gid4 targets proteins in particular through their N-terminal (Nt) proline (Pro) residue. In and other yeasts, the gluconeogenic enzymes Fbp1, Icl1, and Mdh2 bear Nt-Pro and are conditionally destroyed by the Pro/N-degron pathway. However, in mammals and in many non- yeasts, for example, in , these enzymes lack Nt-Pro. We used to explore evolution of the Pro/N-degron pathway. One question to be addressed was whether the presence of non-Pro Nt residues in Fbp1, Icl1, and Mdh2 was accompanied, on evolutionary time scales ( and diverged ∼150 million years ago), by a changed specificity of the Gid4 N-recognin. We used yeast-based two-hybrid binding assays and protein-degradation assays to show that the non-Pro (Ala) Nt residue of Fbp1 makes this enzyme long-lived in . We also found that the replacement, through mutagenesis, of Nt-Ala and the next three residues of Fbp1 with the four-residue Nt-PTLV sequence of Fbp1 sufficed to make the resulting "hybrid" Fbp1 a short-lived substrate of Gid4 in . We consider a blend of quasi-neutral genetic drift and natural selection that can account for these and related results. To the best of our knowledge, this work is the first study of the ubiquitin system in , including development of the first protein-degradation assay (based on the antibiotic blasticidin) suitable for use with this organism.