新規血友病 A ラットモデルにおける重度の自然出血表現型は、血小板 FVIII 発現によって救済される

The severe spontaneous bleeding phenotype in a novel hemophilia A rat model is rescued by platelet FVIII expression.

• Qizhen Shi
• Jeremy G Mattson
• Scot A Fahs
• Aron M Geurts
• Hartmut Weiler
• Robert R Montgomery

抄録

これまでの研究では、血小板特異的第VIII因子（FVIII）の発現（2bF8）は、既存の阻害剤を用いても血友病A（HA）マウスの止血を回復させ、免疫寛容を誘導することが示されている。ここで私たちは、ラットHA（重症HA患者で頻繁に起こる自然出血を模倣したモデル）において、血小板FVIIIの発現が重症自然出血を予防できるかどうかを初めて検討しました。CRISPR/Cas9戦略を用いて、ラットFVIII遺伝子のほぼ全体を反転させたDahl近交系の新規FVIII-/-ラットモデル（Dahl-FVIII-/-）を作製した。血漿中に検出可能なFVIIIは存在しなかった。軟部組織、筋肉、または関節の自然出血は、FVIII-/-ラットの100％で発生した。61％が、組換えヒトFVIII注入の2回以上の投与後に抗FVIII阻害剤を発現した。しかしながら、2bF8トランスジーンをFVIII-/-バックグラウンドに交配した場合、得られた2bF8tg+FVIII-/-ラット（血小板FVIIIレベルが28.26±7.69mU/108血小板、検出不可能な血漿FVIIIレベルを有する）のいずれも自然出血を起こしたことはなかった。2bF8tg骨髄（BM）をFVIII-/-ラットに移植したところ、7人中1人だけがBM再構成の初期段階であざができたが、それ以外の自然出血は試験期間中に観察されなかった。血小板FVIII発現後にFVIII/-ラットの出血性障害が改善されたことを確認するために、回転式トロンボエラストメトリーおよび全血トロンビン生成アッセイを行った。2bF8tg BM移植レシピエントのすべてのパラメータは、FVIII-/-コントロールラットと比較して有意に改善された。特筆すべきは、2bF8tg BM移植レシピエントでは、血漿中のFVIIIの検出可能なレベルも抗FVIII阻害剤も検出されなかったことである。このように、血小板特異的FVIII発現は、抗FVIII抗体の発現がないFVIII-/-ラットにおいて、重度の自然出血を効率的に予防することができる。

Previous studies have shown that platelet-specific factor VIII (FVIII) expression (2bF8) restores hemostasis and induces immune tolerance in hemophilia A (HA) mice even with preexisting inhibitors. Here we investigated for the first time whether platelet FVIII expression can prevent severe spontaneous bleeding in rat HA, a model mimicking the frequent spontaneous bleeding in patients with severe HA. A novel FVIII-/- rat model in a Dahl inbred background (Dahl-FVIII-/-) with nearly the entire rat FVIII gene inverted was created by using a CRISPR/Cas9 strategy. There was no detectable FVIII in plasma. Spontaneous bleeding in the soft tissue, muscles, or joints occurred in 100% of FVIII-/- rats. Sixty-one percent developed anti-FVIII inhibitors after ≥2 doses of recombinant human FVIII infusion. However, when 2bF8 transgene was crossed into the FVIII-/- background, none of the resulting 2bF8tg+FVIII-/- rats (with platelet FVIII levels of 28.26 ± 7.69 mU/108 platelets and undetectable plasma FVIII) ever had spontaneous bleeding. When 2bF8tg bone marrow (BM) was transplanted into FVIII-/- rats, only 1 of 7 recipients had a bruise at the early stage of BM reconstitution, but no other spontaneous bleeding was observed during the study period. To confirm that the bleeding diathesis in FVIII-/- rats was ameliorated after platelet FVIII expression, rotational thromboelastometry and whole-blood thrombin generation assay were performed. All parameters in 2bF8tg BM transplantation recipients were significantly improved compared with FVIII-/- control rats. Of note, neither detectable levels of plasma FVIII nor anti-FVIII inhibitors were detected in 2bF8tg BM transplantation recipients. Thus, platelet-specific FVIII expression can efficiently prevent severe spontaneous bleeding in FVIII-/- rats with no anti-FVIII antibody development.

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