ハロバクテリウム・サリナラムNRC-1由来チオレドキシンの触媒機構と進化の特徴

Catalytic mechanism and evolutionary characteristics of thioredoxin from Halobacterium salinarum NRC-1.

• Shigeki Arai
• Chie Shibazaki
• Rumi Shimizu
• Motoyasu Adachi
• Matsujiro Ishibashi
• Hiroko Tokunaga
• Masao Tokunaga

抄録

チオレドキシン（TRX）は酸化ストレスに対する重要な抗酸化物質である。その中でも最も酸性残基含量の高いHalobacterium salinarum NRC-1 (HsTRX-A)を用いて、その触媒機構と進化の特徴を明らかにした。X線結晶構造解析の結果、HsTRX-Aの主鎖構造は同種のTRXと類似しており、例えば、C原子の二乗平均平方根偏差は、現存する古生物のTRXでは2.3Å以下、復活した先カンブリア紀のTRXでは1.5Å以下であることがわかった。HsTRX-Aの活性部位（Cys45とCys48）の近くには、ユニークな水のネットワークが存在し、高塩環境下での基質の還元に必要なプロトン移動を促進している可能性がある。また、分子表面の負電荷密度が高い（3.6×10eÅ）ことから、溶解性と耐塩性が向上していると考えられる。さらに、柔軟性のある長いN末端領域（Ala2-Pro17）を欠失させた変異体HsTRX-Aを用いた円二色性測定と酵素活性測定の結果、Ala2-Pro17は高塩分環境下（2M NaCl以上）でHsTRX-Aの構造安定性と酵素活性を向上させることが明らかになった。HsTRX-AのN末端領域の伸長は、親水性と酸性残基の増加に伴うものであるが、活性部位の構造には影響を与えないことがわかった。これらの観察結果は、親水性タンパク質に関連したバイオテクノロジーへの応用の可能性を示唆するものである。

Thioredoxin (TRX) is an important antioxidant against oxidative stress. TRX from the extremely halophilic archaeon Halobacterium salinarum NRC-1 (HsTRX-A), which has the highest acidic residue content [(Asp + Glu)/(Arg + Lys + His) = 9.0] among known TRXs, was chosen to elucidate the catalytic mechanism and evolutionary characteristics associated with haloadaptation. X-ray crystallographic analysis revealed that the main-chain structure of HsTRX-A is similar to those of homologous TRXs; for example, the root-mean-square deviations on C atoms were <2.3 Å for extant archaeal TRXs and <1.5 Å for resurrected Precambrian TRXs. A unique water network was located near the active-site residues (Cys45 and Cys48) in HsTRX-A, which may enhance the proton transfer required for the reduction of substrates under a high-salt environment. The high density of negative charges on the molecular surface (3.6 × 10 e Å) should improve the solubility and haloadaptivity. Moreover, circular-dichroism measurements and enzymatic assays using a mutant HsTRX-A with deletion of the long flexible N-terminal region (Ala2-Pro17) revealed that Ala2-Pro17 improves the structural stability and the enzymatic activity of HsTRX-A under high-salt environments (>2 M NaCl). The elongation of the N-terminal region in HsTRX-A accompanies the increased hydrophilicity and acidic residue content but does not affect the structure of the active site. These observations offer insights into molecular evolution for haloadaptation and potential applications in halophilic protein-related biotechnology.