高分解能質量分析法による脂肪酸合成酵素活性と生成物特異性のモニタリングのためのシンプルでダイレクトなアッセイ

A Simple and Direct Assay for Monitoring Fatty Acid Synthase Activity and Product-Specificity by High-Resolution Mass Spectrometry.

• Magdalena Topolska
• Fernando Martínez-Montañés
• Christer S Ejsing

抄録

脂肪酸合成は、すべての真核生物における重要な酵素プロセスです。脂肪酸合成は、グルコースやその他の栄養素を脂肪酸アシル (FA) チェーンに変換することに関与しており、細胞が膜、エネルギー貯蔵、およびシグナル伝達分子のビルディング ブロックとして使用します。この多段階酵素プロセスの中心は、生化学的教科書によると、主に非エステル化パルミチン酸（NEFA 16:0）を、哺乳類で生産する細胞質タイプI脂肪酸合成酵素複合体（FASN）です。FASNの活性は、一般的に反応物であるNADPHの消費を監視する分光光度法ベースのアッセイを使用して測定されます。このアッセイは間接的であり、NADPHを使用する干渉プロセスによって偏る可能性があり、FASNによって生成されたNEFA鎖長を報告することができません。これらの分析上の注意点を回避するために、我々はFASNの活性とその製品特異性を監視することができる簡単な質量分析ベースのアッセイを開発しました。このアッセイでは、(i)精製されたFASNをC標識マロニル-CoA、アセチル-CoA、およびNADPHとインキュベートし、(ii)定義された時点で反応混合物を内部NEFA標準物質でスパイクして抽出し、(iii)抽出物を直接、真空蒸着や化学的誘導体化を行わずに、負イオンモードでの直接注入高分解能質量分析法で分析します。このアッセイは、本質的にノイズのない検出と合成C標識NEFAの絶対定量をサポートしています。我々は、精製された牛FASNの特異的な活性を決定することによって、我々のアッセイの有効性を実証し、標準的なNEFA 16:0に加えて、この酵素はまた、NEFA 12:0、14:0、18:0、および20:0を生成することを示しています。我々は、我々のアッセイは一般的であり、95,000という低い分解能を持つ一般的に利用可能な高分解能質量分析計を使用して実施することができることに注意してください。我々は、我々の単純なアッセイは、強力なFASN阻害剤を開発するためのハイスループットスクリーニング技術として、また、脂肪酸合成酵素の活性と生成物のランドスケープを調節することを目的とした酵素工学のために使用することができると考えています。

fatty acid synthesis is a pivotal enzymatic process in all eukaryotic organisms. It is involved in the conversion of glucose and other nutrients to fatty acyl (FA) chains, that cells use as building blocks for membranes, energy storage, and signaling molecules. Central to this multistep enzymatic process is the cytosolic type I fatty acid synthase complex (FASN) which in mammals produces, according to biochemical textbooks, primarily non-esterified palmitic acid (NEFA 16:0). The activity of FASN is commonly measured using a spectrophotometry-based assay that monitors the consumption of the reactant NADPH. This assay is indirect, can be biased by interfering processes that use NADPH, and cannot report the NEFA chain-length produced by FASN. To circumvent these analytical caveats, we developed a simple mass spectrometry-based assay that affords monitoring of FASN activity and its product-specificity. In this assay (i) purified FASN is incubated with C-labeled malonyl-CoA, acetyl-CoA, and NADPH, (ii) at defined time points the reaction mixture is spiked with an internal NEFA standard and extracted, and (iii) the extract is analyzed directly, without vacuum evaporation and chemical derivatization, by direct-infusion high-resolution mass spectrometry in negative ion mode. This assay supports essentially noise-free detection and absolute quantification of synthetized C-labled NEFAs. We demonstrate the efficacy of our assay by determining the specific activity of purified cow FASN and show that in addition to the canonical NEFA 16:0 this enzyme also produces NEFA 12:0, 14:0, 18:0, and 20:0. We note that our assay is generic and can be carried out using commonly available high-resolution mass spectrometers with a resolving power as low as 95,000. We deem that our simple assay could be used as high-throughput screening technology for developing potent FASN inhibitors and for enzyme engineering aimed at modulating the activity and the product-landscape of fatty acid synthases.