N-アセチルノイラミン酸産生のための高閾値を持つリボスイッチのin vivo進化工学

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Metab. Eng..2020 05;59:36-43. S1096-7176(19)30409-4. doi: 10.1016/j.ymben.2020.01.002.Epub 2020-01-16.

N-アセチルノイラミン酸産生のための高閾値を持つリボスイッチのin vivo進化工学

In vivo evolutionary engineering of riboswitch with high-threshold for N-acetylneuraminic acid production.

Qingxiao Pang
Hao Han
Xiaoqin Liu
Zhiguo Wang
Quanfeng Liang
Jin Hou
Qingsheng Qi
Qian Wang

PMID: 31954846 DOI: 10.1016/j.ymben.2020.01.002.

抄録

リボスイッチの応用には、感度、閾値、ダイナミックレンジなどの所望の特性を持つリボスイッチが重要である。しかし、天然のリボスイッチの特性変更は、アプタマーのリガンド結合特性の理解や、合理的・非合理的な設計のための適切なスクリーニング方法がないために困難である。本研究では、ポジティブ選択とネガティブ選択の両方を組み合わせた成長結合スクリーニングに基づいて、リボスイッチのしきい値を変化させる有効な方法を生体内で確立した。この方法の実現可能性は、モデルライブラリを用いて検証した。この方法を用いて、N-アセチルノイラミン酸（NeuAc）リボスイッチを進化させ、高い閾値と大きなダイナミックレンジを持つ修飾リボスイッチを得た。次に、新しい NeuAc リボスイッチを用いて、リボソーム結合部位と NeuAc 生合成経路の鍵となる遺伝子を最適化した。その結果、グルコースを唯一の炭素源とした場合には、これまでに報告されている14.32g/lという最高のNeuAc生産量を得ることができました。

Riboswitches with desired properties, such as sensitivity, threshold, dynamic range, is important for its application. However, the property change of a natural riboswitch is difficult due to the lack of the understanding of aptamer ligand binding properties and a proper screening method for both rational and irrational design. In this study, an effective method to change the threshold of riboswitch was established in vivo based on growth coupled screening by combining both positive and negative selections. The feasibility of the method was verified by the model library. Using this method, an N-acetylneuraminic acid (NeuAc) riboswitch was evolved and modified riboswitches with high threshold and large dynamic range were obtained. Then, using a new NeuAc riboswitch, both ribosome binding sites and key gene in NeuAc biosynthesis pathway were optimized. The highest NeuAc production of 14.32 g/l that has been reported using glucose as sole carbon source was obtained.