16S rRNA遺伝子に基づくプライマー対は、淡水Brocadiales anammox菌の検出において高い特異性と定量精度を示した

16S rRNA gene-based primer pair showed high specificity and quantification accuracy in detecting freshwater Brocadiales anammox bacteria.

• Chang Ding
• Lorenz Adrian
• Yongzhen Peng
• Jianzhong He

抄録

嫌気性アンモニウム酸化細菌（アナモックス）は広く分布しており、地球規模の窒素循環に大きく貢献している。従来、16S rRNA遺伝子に基づく同定・定量は、Brocadiales内での16S rRNA遺伝子の配列同一性が低いため、信頼性が低いと考えられていた。ここでは、適切なプライマーと方法を用いることで、アナモックス菌の16Sベースの検出と定量が正確にできるという仮説を立てている。既存の16S rRNA遺伝子ベースのプライマーペア（Amx694F-Amx960R）を、1ヌクレオチド（Amx694Fの位置18、G→C）を変更して（Amx694PF-Amx960R）、ほとんどのBrocadialesアナモックス菌の配列と一致するように改変し、改変したプライマーペアを、様々な地理的起源を持つ微小生態系、アナモックス反応器、排水処理場から採取した29の淡水サンプルを用いて評価した。このプライマーペアは、0.1%以上のアナモックス菌を含むサンプルにおいて、アナモックス個体群の検出と定量において高い特異性を示した。また，定量的リアルタイムPCR法によるアナモックス個体数の定量と変性勾配ゲル電気泳動法によるアナモックス種の同定は，増幅器配列決定の結果とよく一致した。また、実験室での培養条件では、アナモックスの個体群が「Candidatus Kuenenia」へと明らかにシフトしていることが確認された。アンプリコンシークエンシングの助けを借りて、16S rRNA遺伝子に基づくアナモックス特異的プライマーが、廃水処理場や天然淡水環境におけるアナモックス群集の定性・定量的モニタリングを実現できることを実証した。

Anaerobic ammonium oxidizing (anammox) bacteria are widely distributed and contribute significantly to the global nitrogen cycle. Traditionally, identification and quantification based on the 16S rRNA gene were considered not reliable because of low 16S rRNA gene sequence identity within Brocadiales. Here we hypothesize that by using appropriate primers and methodology, 16S-based detection and quantification of anammox bacteria can be accurate. We modified an existing 16S rRNA gene-based primer pair (Amx694F-Amx960R) by changing one nucleotide (Amx694F position 18, G→C) (Amx694PF-Amx960R) so that they match the sequences of most Brocadiales anammox bacteria, and evaluated the modified primer pair with 29 freshwater samples from microcosms, anammox reactors and wastewater treatment plants of various geographical origins. The primer pair showed high specificity in detection and quantification of anammox populations in samples that contained >0.1% anammox bacteria. Quantification of anammox abundance by quantitative real-time PCR and delineation of anammox species by denaturing gradient gel electrophoresis agreed well with amplicon sequencing results. A clear shift of anammox population towards 'Candidatus Kuenenia' was observed under laboratory cultivation conditions. With the help of amplicon sequencing, we demonstrated that 16S rRNA gene-based anammox-specific primers are able to achieve qualitative and quantitative monitoring of anammox communities in wastewater treatment plants and natural freshwater environments.2007;73:5261-7.

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