ガンマ-ヒドロキシ酪酸脱水素酵素のキネティクスの側面

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Biochim Biophys Acta Proteins Proteom.2020 05;1868(5):140376. S1570-9639(20)30017-0. doi: 10.1016/j.bbapap.2020.140376.Epub 2020-01-22.

ガンマ-ヒドロキシ酪酸脱水素酵素のキネティクスの側面

Kinetics aspects of Gamma-hydroxybutyrate dehydrogenase.

Esther S Taxon
Lila P Halbers
Stanley M Parsons

PMID: 31981617 DOI: 10.1016/j.bbapap.2020.140376.

抄録

代謝的に関連する酵素の2つのグループ、鉄依存性アルコール脱水素酵素（ADH）のIII族とIII族ADHを活性化するx（nudix）ヒドロラーゼに連結されたヌクレオシド二リン酸塩の別個のサブファミリーは、十分に特性化されていません。ここでは、融合タンパク質としてCupriavidus necatorからクローン化されたIII族ADH、すなわちγ-ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（GHBDH、UniProt：Q59104）の定常初速順方向（アルコール→アルデヒド）反応を報告する。また、GHBDH反応に対するnudixヒドロラーゼの影響についても報告する。最適pH9.0では、GHBDH反応は2種類の異なる飽和精製nudixヒドロラーゼ、すなわちBacillus methanolicus activator (ACT, UniProt: I3EA59)とEscherichia coli NudF (UniProt: Q93K97)タンパク質によって2倍程度に活性化された。生理的pH値7.0では、ACTは3.5倍以上の活性化を示した。また、ACT活性化反応の初期速度をpH9.0で測定したところ、どちらの場合もコハク酸セマルアルデヒド対GHBの競合的な阻害が見られ、他の3つの基質の組み合わせによる非競合的な阻害が見られた。このパターンは、モノ-イソセオレル-チャンス反応におけるNADの最初の結合と一致している。GHBDHの重要な残基の変異体も特徴づけられた。すべてのIII族ADHの間で保存され、以前に重要な一般的な塩基であることが提案されたH265は、H265Aに関連するGHBDH活性のために〜4倍だけ有用である。以前に提案された4つの保存されたFeキレート剤（D193、H197、H261およびH280）は、それぞれGHBDH活性のために不可欠である。また、順方向の反応では亜塩素酸による刺激が、逆方向の反応ではACTによる刺激がないことが確認された。

Two groups of metabolically related enzymes, the Group III family of Fe-dependent alcohol dehydrogenases (ADHs) and the separate subfamily of nucleoside diphosphates linked to x (nudix) hydrolases that activate Group III ADHs are under-characterized. Here we report the steady-state initial-velocity forward direction (alcohol → aldehyde) reaction of a Group III ADH, namely gamma-hydroxybutyrate dehydrogenase (GHBDH, UniProt: Q59104), cloned from Cupriavidus necator as a fusion protein. We also report the effects of nudix hydrolases on the GHBDH reaction. At optimal pH 9.0, the GHBDH reaction is activated ~2-fold by two different saturating purified nudix hydrolases, namely Bacillus methanolicus activator (ACT, UniProt: I3EA59) and Escherichia coli NudF (UniProt Q93K97) proteins. At physiological pH values of ~7.0, ACT activates by >3.5-fold. Initial-rate characterization at pH 9.0 of the forward direction un-activated and ACT-activated reactions show for both cases competitive inhibition by the product succinic semialdehyde versus GHB, and noncompetitive inhibitions by the three other substrate-product combinations. This pattern is consistent with NAD binding first in Mono-Iso Theorell-Chance kinetics. Mutants of some possibly important residues in GHBDH also were characterized. H265, conserved among all Group III ADHs and previously proposed to be a critical general base, is only ~4-fold helpful for GHBDH activity relevant to H265A. The four previously proposed conserved Fe chelators (D193, H197, H261 and H280) each are essential for GHBDH activity. A 2-step explanation for cross-species stimulation by sub-stoichiometric ACT in the forward direction and confirmed lack of ACT stimulation in the reverse direction reaction is proposed.