ペプチドや小タンパク質のためのMALDI-重水素-重水素交換質量分析法によるリポソーム人工膜透過性アッセイ

Liposome Artificial Membrane Permeability Assay by MALDI-hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry for peptides and small proteins.

• Alexey A Makarov
• Gregory F Pirrone
• Vladimir Shchurik
• Erik L Regalado
• Ian Mangion

抄録

製薬業界では、ペプチドやタンパク質をベースとした治療薬の研究が盛んに行われていますが、ペプチドや小タンパク質の膜透過性を迅速かつ堅牢に測定することが急務となっています。本研究では、MALDI-TOF-MSを利用して、差動重水素交換（HDX）法と組み合わせて人工リポソーム膜を介してペプチドとタンパク質の透過性を研究するためのシンプルで効率的なアプローチが記載されています。非水性（アプロティック）マトリックスは、望ましくない水素-重水素逆交換を排除するために、MALDIサンプル調製との使用のために評価された。ペプチドおよびタンパク質をリポソームとインキュベートし、時間をかけてリポソーム膜への浸透をMALDI-MSによって測定した。リポソームの外側のペプチドと内側のペプチドを区別するために、差動HDXアプローチを使用した。これに関して、リポソームの外側のペプチドは、重水素酸化物への短時間の暴露を用いて標識され、リポソームの内側のペプチドは標識から保護された。その後、MALDI-TOF-MSを用いて、ペプチドとタンパク質サンプルの非標識対標識ピーク面積比を比較した。この概念実証研究では、3つのよく知られた膜活性モデルペプチド（メリチン、アラメチシン、グラミシジン）と2つのモデルタンパク質（アプロチニンとユビキチン）を研究するために、リポソーム人工膜透過性アッセイ（LAMPA）のワークフローを開発しました。これにより得られた透過性の結果は、これまでに報告された研究対象のペプチドおよびタンパク質のデータにより裏付けられた。提案したMALDI-HDX-MSによるLAMPAは、ペプチドや小タンパク質の膜透過性の研究やランク付けに超ハイスループットで応用できる。

The pharmaceutical industry's focus has expanded to include peptide and protein-based therapeutics; however, some analytical challenges have arisen along the way, including the urgent need for fast and robust measurement of the membrane permeability of peptides and small proteins. In this study, a simple and efficient approach that utilizes MALDI-TOF-MS to study peptide and protein permeability through an artificial liposome membrane in conjunction with a differential hydrogen-deuterium exchange (HDX) methodology is described. A non-aqueous (aprotic) matrix was evaluated for use with MALDI sample preparation in order to eliminate undesirable hydrogen-deuterium back-exchange. Peptides and proteins were incubated with liposomes and their penetration into the liposome membrane over time was measured by MALDI-MS. A differential HDX approach was used to distinguish the peptides outside of the liposome from those inside. In this regard, the peptides on the outside of the liposomes were labeled using short exposure to deuterium oxide, while the peptides inside of the liposomes were protected from labeling. Subsequently, the unlabeled versus labeled peak area ratios for peptide and protein samples were compared using MALDI-TOF-MS. In this proof-of-concept study, we developed the Liposome Artificial Membrane Permeability Assay (LAMPA) workflow to study three well-known membrane-active model peptides (melittin, alamethicin, and gramicidin) and two model proteins (aprotinin and ubiquitin). The permeability results obtained from this were corroborated by previously reported data for studied peptides and proteins. The proposed LAMPA by MALDI-HDX-MS can be applied in an ultra-high-throughput manner for studying and rank-ordering membrane permeability of peptides and small proteins.

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