金属汚染環境下で増殖した海洋神経毒性渦鞭毛藻Alexandrium pacificumの膜プロテオーム、細胞増殖、形態測定における異種間の変動性

Intraspecific variability in membrane proteome, cell growth, and morphometry of the invasive marine neurotoxic dinoflagellate Alexandrium pacificum grown in metal-contaminated conditions.

• Cherif Chetouhi
• Estelle Masseret
• Cecilia Teodora Satta
• Thierry Balliau
• Mohamed Laabir
• Natacha Jean

抄録

過去数十年の間に、人為的な影響を受けた沿岸地域では、二枚鞭毛藻類のAlexandrium pacificumが関与する有害な藻類ブルームの発生、分布、強度が増加している。この外来種はサキシトキシンを産生し、汚染された魚介類を摂取すると人間に麻痺性貝類中毒症候群を引き起こす。金属で汚染された沿岸生態系では、A. pacificumのブルームが報告されており、これらの微生物が金属ストレス環境に適応し、抵抗する能力を持っていることが示唆されている。本研究では、金属ストレス（Zn、Pb、Cu、Cdの添加）に対する膜プロテオーム（LC-MS/MSと結合した2次元電気泳動による）、細胞増殖および形態学的変化（倒立顕微鏡による測定）の特徴を明らかにすることを目的としている。SG C10-3とTAR C5-4Fで、それぞれサンタ・ジュスタラグーン（イタリア、サルデーニャ）とタラゴナ港（スペイン）から分離した。金属カクテルで増殖させたSG C10-3培養物では、細胞の増殖が著しく遅れ、細胞サイズが増加した（25日後の37.5μm細胞の22％）。逆に、金属カクテルで増殖させた TAR C5-4F 培養物では、細胞増殖や細胞サイズに大きな変化は見られなかった（P>0.10）ことから、金属汚染に対する A. pacificum 菌株の反応には種内変動性があることが示唆された。膜プロテオームを構成するタンパク質の総数は、試験条件にかかわらず、TAR C5-4Fの方がSG C10-3よりも有意に多かった。また、膜プロテオームを構成するタンパク質の総数は、両株とも金属ストレスの影響を受けて有意に減少した（SG C10-3では29％減少した）。一方、TAR C5-4Fのプロテオームは17％減少した。コントロールでは101±8蛋白質、金属汚染培養では84±5蛋白質）。)さらに、ストレスに応答して発現が大きく変化したタンパク質は、系統にかかわらず、主にダウンレギュレーションされており（SG C10-3ではプロテオームの45％、TAR C5-4Fでは38％）、金属の有害な影響を明確に示していることがわかった。タンパク質のダウンレギュレーションは、細胞輸送（SG C10-3 のアクチンおよびリン脂質スクランブラーゼ）、光合成（SG C10-3 のルビスコ、TAR C5-4F の光捕集タンパク質、高 CO 誘導性ペリプラズムタンパク質）、最終的にはエネルギー代謝（両株の ATP シンターゼ）に影響を及ぼす可能性がある。しかしながら、タンパク質の発現における他の改変は、これらのA. pacificum株に、例えば、(i) SG C10-3細胞の細胞質膜を介した金属の侵入を制限する（スクランブラーゼのダウンレギュレーションを介して）、および/または(ii) SG C10-3およびTAR C5-4F細胞における金属によって生成される酸化ストレスを減少させる（ATP合成酵素のダウンレギュレーションによる）ことによって、金属ストレス条件への適応および/または抵抗力の能力を付与することが考えられる。

Over the past decades, the occurrence, distribution and intensity of harmful algal blooms involving the dinoflagellate Alexandrium pacificum have increased in marine coastal areas disturbed by anthropogenic inputs. This invasive species produces saxitoxin, which causes the paralytic shellfish poisoning syndrome in humans upon consumption of contaminated seafood. Blooms of A. pacificum have been reported in metal-contaminated coastal ecosystems, suggesting some ability of these microorganisms to adapt to and/or resist in metal stress conditions. This study seeks to characterize the modifications in membrane proteomes (by 2-D electrophoresis coupled to LC-MS/MS), cell growth and morphometry (measured with an inverted microscope), in response to metal stress (addition of Zn, Pb, Cu and Cd), in two Mediterranean A. pacificum strains: SG C10-3 and TAR C5-4F, respectively isolated from the Santa Giusta Lagoon (Sardinia, Italy) and from the Tarragona seaport (Spain), both metal-contaminated ecosystems. In the SG C10-3 cultures grown in a metal cocktail, cell growth was significantly delayed, and cell size increased (22% of 37.5 μm cells after 25 days of growth). Conversely, no substantial change was observed for cell growth or cell size in the TAR C5-4F cultures grown in a metal cocktail (P > 0.10), thus indicating intraspecific variability in the responses of A. pacificum strains to metal contamination. Regardless of the conditions tested, the total number of proteins constituting the membrane proteome was significantly higher for TAR C5-4F than for SG C10-3, which may help TAR C5-4F to thrive better in contaminated conditions. For both strains, the total number of proteins constituting the membrane proteomes was significantly lower in response to metal stress (29% decrease in the SG C10-3 proteome: 82 ± 12 proteins for controls, and 58 ± 12 in metal-contaminated cultures; 17% decrease in the TAR C5-4F proteome: 101 ± 8 proteins for controls, and 84 ± 5 in metal-contaminated cultures). Moreover, regardless of the strain, proteins with significantly modified expression in response to stress were mainly down-regulated (representing 45% of the proteome for SG C10-3 and 38% for TAR C5-4F), clearly showing the harmful effects of the metals. Protein down-regulation may affect cell transport (actin and phospholipid scramblase in SG C10-3), photosynthesis (RUBISCO in SG C10-3, light-harvesting protein in TAR C5-4F, and high-CO-inducing periplasmic protein in both strains), and finally energy metabolism (ATP synthase in both strains). However, other modifications in protein expression may confer to these A. pacificum strains a capacity for adaptation and/or resistance to metal stress conditions, for example by (i) limiting the metal entry through the plasma membrane of the SG C10-3 cells (via the down-regulation of scramblase) and/or (ii) reducing the oxidative stress generated by metals in SG C10-3 and TAR C5-4F cells (due to down-regulation of ATP-synthase).

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