鉄硫黄亜鉛フィンガータンパク質CPSF30のRNA結合特性の解明

Unraveling the RNA Binding Properties of the Iron-Sulfur Zinc Finger Protein CPSF30.

• Jordan D Pritts
• Matthew S Hursey
• Jamie L Michalek
• Sharon Batelu
• Timothy L Stemmler
• Sarah L J Michel

抄録

クレイバージおよびポリアデニル化特異性因子30（CPSF30）は、プレmRNAからRNAへの移行において重要な役割を果たす「ジンクフィンガー」タンパク質である。CPSF30は、5つの保存されたCCCHドメインとCCHC「ジンクナックル」ドメインを含んでいます。CPSF30の活性は、プレmRNAの処理に重要である。CPSF30は、CCCHドメインのみが存在する切り詰められた形で、AU-rich pre-mRNA標的に特異的に結合することが示されているが、完全長のCPSF30のRNA結合および認識特性は知られていない。ここでは、完全長CPSF30の単離と生化学的特性について報告する。CPSF30は、誘導結合プラズマ質量分析法、紫外可視分光法、X線吸収分光法で測定した結果、5つの亜鉛イオンに加えて1つの2Fe-2Sクラスターを含んでいることを報告する。蛍光異方性RNA結合アッセイを用いて、全長CPSF30が2種類のプレmRNAターゲット、AAUAAAとpolyUに高い結合親和性を持つことを明らかにした。AAUAAAモチーフへの結合には、CPSF30の5つのCCCHドメインが必要であるのに対し、polyU配列への結合には完全長のCPSF30が必要である。これらの知見は、全長タンパク質に存在するCCHC「ジンクナックル」がpolyU結合を媒介するために重要であることを示唆している。また、2つのCCCHドメイン（ZF2とZF3）またはCCHC「ジンクナックル」ドメインのいずれかだけを含むこのタンパク質の切断形態は、RNA結合を示さないことが報告されています。

Cleavage and polyadenylation specificity factor 30 (CPSF30) is a "zinc finger" protein that plays a crucial role in the transition of pre-mRNA to RNA. CPSF30 contains five conserved CCCH domains and a CCHC "zinc knuckle" domain. CPSF30 activity is critical for pre-mRNA processing. A truncated form of the protein, in which only the CCCH domains are present, has been shown to specifically bind AU-rich pre-mRNA targets; however, the RNA binding and recognition properties of full-length CPSF30 are not known. Herein, we report the isolation and biochemical characterization of full-length CPSF30. We report that CPSF30 contains one 2Fe-2S cluster in addition to five zinc ions, as measured by inductively coupled plasma mass spectrometry, ultraviolet-visible spectroscopy, and X-ray absorption spectroscopy. Utilizing fluorescence anisotropy RNA binding assays, we show that full-length CPSF30 has high binding affinity for two types of pre-mRNA targets, AAUAAA and polyU, both of which are conserved sequence motifs present in the majority of pre-mRNAs. Binding to the AAUAAA motif requires that the five CCCH domains of CPSF30 be present, whereas binding to polyU sequences requires the entire, full-length CPSF30. These findings implicate the CCHC "zinc knuckle" present in the full-length protein as being critical for mediating polyU binding. We also report that truncated forms of the protein, containing either just two CCCH domains (ZF2 and ZF3) or the CCHC "zinc knuckle" domain, do not exhibit any RNA binding, indicating that CPSF30/RNA binding requires several ZF (and/or Fe-S cluster) domains working in concert to mediate RNA recognition.