ヒト血漿中での簡便かつ高感度なUHPLC-MS/MSアッセイを用いた改良型チトクロムP450フェノタイピングカクテルの開発

An improved cytochrome P450 phenotyping cocktail with a simplified and highly sensitive UHPLC-MS/MS assay in human plasma.

• Shane K Eagles
• Xiaosuo Wang
• Annette S Gross
• Andrew J McLachlan

抄録

チトクローム P450（CYP）酵素の薬物代謝活性の生体内変化を測定することは、薬物と薬物、食事、薬物と疾患の相互作用を理解し、評価する上で非常に重要です。超高速液体クロマトグラフィー タンデム質量分析法 (UHPLC-MS/MS) の感度と特異性は、生物学的マトリックス中の薬物とその代謝物の分析に理想的なツールであり、さまざまなアプリケーションにおける CYP 表現型測定に有用であることが実証されています。公表されているCYP表現型カクテルアッセイは、多くの場合、大容量の血漿サンプル（0.5～1mL）を必要とし、感度が比較的低く、多段階の複雑なサンプル調製および抽出手順を必要とします。さらに、回収率とマトリックス効果を調査し報告する方法にはばらつきがあり、一部の研究ではこれらのデータを完全に報告していないものもある。そこで、本研究の目的は、ヒト血漿中の少量（100μL）のプローブ薬物であるカフェイン（CYP1A2で代謝される）、オメプラゾール（CYP2C19）、ロサルタン（CYP2C9）、デキストロメトルファン（CYP2D6）、ミダゾラム（CYP3A4）およびそれぞれの酵素特異的代謝物の簡易アッセイ法を開発し、検証し、最適化することである。分析物の抽出には、アセトニトリルによるタンパク質沈殿と固相抽出 (SPE) を使用しました。サンプルは、Agilent 1290 infinity LC システムと 6460A トリプル四重極質量分析計を併用して分析しました。アッセイは、特異度、感度（分析物 LLOQs 0.78-23.4ng/mL）、精度（日内 RE% 公称濃度 90.7-110.2%; 日間 RE% 87.0-110.5%）、精度（日内分析物 RSD% 0.46-11.4%; 日間 RSD% 1.36-11.2%）の FDA ガイドライン推奨要件を満たしていました。回収率とマトリックスの影響を徹底的に調査し、アッセイの性能を阻害する可能性のあるものとして除外しました。このアッセイは、ヒト臨床試験参加者のCYP活性を表現型化するために成功裏に使用されている。重要なことは、著者らは、CYPフェノタイピングカクテルアッセイの文献でよく見られる問題点についての現代的な解説を提供し、ベストプラクティスのアプローチとこの分野におけるデータ報告の標準化に関する提言を行うことです。

Measuring in vivo changes in the drug metabolizing activity of cytochrome P450 (CYP) enzymes is critical to understanding and assessing drug-drug, drug-diet and drug-disease interactions. The sensitivity and specificity of ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) makes it an ideal tool for analyzing drugs and their metabolites in biological matrices, and has demonstrated utility in CYP phenotyping across varied applications. Published CYP phenotyping cocktail assays often require large plasma sample volumes (0.5-1 mL), have relatively low sensitivity and multi-step complex sample preparation and extraction procedures. Further, variability exists in the way that recovery and matrix effects are investigated and reported, and some studies fail to report these data altogether. Therefore, the aim of this study was to develop, validate and optimize a simplified assay for the probe drugs caffeine (metabolized by CYP1A2), omeprazole (CYP2C19), losartan (CYP2C9), dextromethorphan (CYP2D6), midazolam (CYP3A4) and their respective enzyme-specific metabolites in small volumes (100 μL) of human plasma, that addresses the issues noted. Analyte extraction involved protein precipitation with acetonitrile and solid-phase extraction (SPE). Samples were analyzed using an Agilent 1290 infinity LC system in tandem with 6460A triple quadrupole mass spectrometers. The assay met FDA guideline-recommended requirements for specificity, sensitivity (analyte LLOQs 0.78-23.4 ng/mL), accuracy (intra-day RE% nominal concentration 90.7-110.2%; inter-day RE% 87.0-110.5%) and precision (intra-day analyte RSD% 0.46-11.4%; inter-day RSD% 1.36-11.2%). Recovery and matrix effects were thoroughly investigated and excluded as potential interferers with assay performance. This assay has been used successfully to phenotype CYP activity in a human clinical trial participant. Importantly, the authors provide a contemporary commentary on commonly found issues in the CYP phenotyping cocktail assay literature, and make recommendations concerning best-practice approaches and the standardization of data reporting in this area.

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