MARCKSの回復は癌の化学感受性を高める

Restoration of MARCKS enhances chemosensitivity in cancer.

• Tim Wenzel
• Thomas Büch
• Nicole Urban
• Ulrike Weirauch
• Katrin Schierle
• Achim Aigner
• Michael Schaefer
• Hermann Kalwa

抄録

目的:

ATP結合カセット（ABC）トランスポーター活性の増加は、がんにおける化学療法抵抗性の主な原因である。ABCトランスポーターファミリーのメンバーABCB1は、しばしば大腸癌（CRC）で過剰発現している。ホスファチジルイノシトール-4,5-ビスホスファット（PI(4,5)P）依存性の経路がABCB1機能の調節に関与している。ミリストイル化アラニンリッチCキナーゼ基質（MARCKS）は、PI(4,5)Pの重要な調節因子であり、遺伝的欠失または高リン酸化により多くのCRC癌で不活性化されている。そのため、MARCKSはABCB1に重大な影響を与えている可能性がある。

PURPOSE: Increased ATP-binding-cassette (ABC) transporter activity is a major cause of chemotherapy resistance in cancer. The ABC transporter family member ABCB1 is often overexpressed in colorectal cancer (CRC). Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PI(4,5)P)-dependent pathways are involved in the regulation of ABCB1 function. The protein Myristoylated Alanine-Rich C-Kinase Substrate (MARCKS) is a pivotal regulator of PI(4,5)P and inactivated in many CRC cancers via genetic deletion or hyperphosphorylation. Therefore, MARCKS may critically impact ABCB1.

方法:

CRC サンプルおよび CRC 細胞株を用いて、免疫蛍光法およびウェスタンブロット法を用いて、MARCKS と ABCB1 の関連性を調べた。ABCB1の機能は、既知のABCB1阻害剤（ベラパミル、タリイカダー）およびキナーゼ阻害剤であるボスチニブを用いて、カルセインインインフルクスアッセイを用いて調べた。ABCB1の内部化とMARCKSの転座は、エンドサイトーシス阻害剤であるクロルプロマジンとダイナソーレを用いて共焦点顕微鏡で解析した。PI(4,5)Pの豊富さは分子内蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)によってモニターされた。生殖細胞の生存は、化学療法剤ドキソルビシンと5-FU（5-FU）への曝露との組み合わせで比色WST-1とクローニングアッセイを介して研究した。

METHODS: CRC samples as well as CRC cell lines were tested for a connection between MARCKS and ABCB1 via immunofluorescence and Western-blot analysis. ABCB1 function was studied via calcein influx assay under treatment with known ABCB1 inhibitors (verapamil, tariquidar) as well as the kinase inhibitor bosutinib. ABCB1 internalization and MARCKS translocation was analyzed via confocal microscopy exploiting the endocytosis inhibitors chlorpromazine and dynasore. Abundance of PI(4,5)P was monitored by intramolecular fluorescence resonance energy transfer (FRET). Reproductive cell survival was studied via colorimetric WST-1 and clonogenic assays in combination with exposure to the chemotherapeutics doxorubicin and 5-fuorouracil (5-FU).

結果:

我々は、MARCKS陰性のCRC患者腫瘍サンプルと確立したCRC細胞株において、ABCB1の発現が増加していることを発見した。メカニズム的には、組換え発現を介したMARCKS機能の再構築またはMARCKSリン酸化の薬理学的阻害により、ABCB1の活性が大幅に低下した。CRC細胞では、ボスチニブ投与により、MARCKSは細胞質から細胞膜へと移動し、同時にABCB1は細胞内コンパートメントへと移動した。ボスチニブによるMARCKSのリン酸化の阻害は、化学療法薬であるドキソルビシンや5-FUに対して細胞をより敏感にした。

RESULTS: We found increased ABCB1 expression in MARCKS negative CRC patient tumor samples and established CRC cell lines. Mechanistically, the reconstitution of MARCKS function via recombinant expression or the pharmacological inhibition of MARCKS phosphorylation led to a substantial decrease in ABCB1 activity. In CRC cells, bosutinib treatment resulted in a MARCKS translocation from the cytosol to the plasma membrane, while simultaneously, ABCB1 was relocated to intracellular compartments. Inhibition of MARCKS phosphorylation via bosutinib rendered cells more sensitive to the chemotherapeutics doxorubicin and 5-FU.

結論:

MARCKSの機能を欠失した細胞では、ABCB1の内部化が不完全であり、ABCB1の活性が高くなり、化学抵抗性を高めることがわかった。このように、MARCKSの機能を欠失した細胞は、ABCB1の内部化が不完全で、ABCB1の活性が高くなり、化学療法に対する抵抗性を高めることが示唆された。

CONCLUSIONS: Cells devoid of MARCKS function showed incomplete ABCB1 internalization, leading to higher ABCB1 activity enhancing chemoresistance. Vice versa our data suggest the prevention of MARCKS inhibition by reversing hyperphosphorylation or genomic restoration after deletion as two promising approaches to overcome tumor cell resistance towards chemotherapeutic ABCB1 substrates.