インビトロでのRNAライターおよびイレイザーの分析に広く適用可能なオリゴヌクレオチド質量分析法

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Nucleic Acids Res..2020 04;48(7):e41. 5742835. doi: 10.1093/nar/gkaa091.

インビトロでのRNAライターおよびイレイザーの分析に広く適用可能なオリゴヌクレオチド質量分析法

Broadly applicable oligonucleotide mass spectrometry for the analysis of RNA writers and erasers in vitro.

Felix Hagelskamp
Kayla Borland
Jillian Ramos
Alan G Hendrick
Dragony Fu
Stefanie Kellner

PMID: 32083657 PMCID: PMC7144906. DOI: 10.1093/nar/gkaa091.

抄録

RNAは、特定の修飾を付加または除去する専用のライタ酵素またはイレイザー酵素によって、それぞれ転写後に修飾されている。オリゴヌクレオチド（ON）の修飾状態を高感度に調べるには、RNAの質量分析（MS）が有用である。ここでは、低分解能・高分解能MSによるONのポジティブイオン検出のためのイオンペアリング試薬フリーのクロマトグラフィーを開発した。我々は、リボザイム融合転写後に自動サイズ排除クロマトグラフィーによって精製されたin vitro転写tRNAのRNase T1ダイジェストからONを決定するためにON-MSを適用します。このようにして生成したtRNAValAACはヒトtRNA ADAT2/3酵素の基質であり、アデノシンからイノシンへの脱アミノ化とtRNAValIACの生成をON-MSで確認した。さらに、低分解能ON-MSを用いて、細菌AlkBによる1-メチルアデノシンを含むONの脱メチル化をin vitroでモニターしています。高分解能ON-MSのパワーは、RNase T1で消化されたネイティブの総tRNAから修飾されたONの検出とマッピングによって実証されています。全体的に、我々は、インビトロでのRNA（脱）修飾プロセスとネイティブRNAのモニタリングに広く適用できるオリゴヌクレオチドMS法を提示しています。

RNAs are post-transcriptionally modified by dedicated writer or eraser enzymes that add or remove specific modifications, respectively. Mass spectrometry (MS) of RNA is a useful tool to study the modification state of an oligonucleotide (ON) in a sensitive manner. Here, we developed an ion-pairing reagent free chromatography for positive ion detection of ONs by low- and high-resolution MS, which does not interfere with other types of small compound analyses done on the same instrument. We apply ON-MS to determine the ONs from an RNase T1 digest of in vitro transcribed tRNA, which are purified after ribozyme-fusion transcription by automated size exclusion chromatography. The thus produced tRNAValAAC is substrate of the human tRNA ADAT2/3 enzyme and we confirm the deamination of adenosine to inosine and the formation of tRNAValIACin vitro by ON-MS. Furthermore, low resolution ON-MS is used to monitor the demethylation of ONs containing 1-methyladenosine by bacterial AlkB in vitro. The power of high-resolution ON-MS is demonstrated by the detection and mapping of modified ONs from native total tRNA digested with RNase T1. Overall, we present an oligonucleotide MS method which is broadly applicable to monitor in vitro RNA (de-)modification processes and native RNA.