LINC00028は、miR-204-5pを標的としたTGFβ1処理ヒトテノンカプセル線維芽細胞の発生を制御する

LINC00028 regulates the development of TGFβ1-treated human tenon capsule fibroblasts by targeting miR-204-5p.

• Huali Sui
• Shanshan Fan
• Wenjing Liu
• Yingchao Li
• Xuan Zhang
• Yunhong Du
• Huijing Bao

抄録

緑内障は、複雑な病態を持つ世界的な失明原因の第一位です。ヒトテノンカプセル線維芽細胞（HTF）の過剰増殖と線維化は、緑内障濾過術後の瘢痕形成の引き金となる。そこで、トランスフォーミング成長因子β1(TGFβ1)治療を受けたHTFにおいて、長鎖遺伝子間非タンパク質コーディングRNA28(LINC00028)の役割とそのメカニズムを明らかにすることを目的とした。LINC00028とmiR-204-5pの発現の検出は、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)を用いて行った。細胞増殖は、セルカウンティングキット-８（ＣＣＫ-８）アッセイにより評価した。細胞遊走および浸潤は、トランスウェルアッセイによりモニターした。E-カドヘリン、α-平滑筋アクチン（α-SMA）、フィブロネクチン、β-カテニンを含む上皮間葉転換（EMT）関連マーカー、およびベクリン1および軽鎖3（LC3-IIおよびLC3-I）を含むオートファジー関連マーカーのタンパク質レベルでの発現をウエスタンブロットを用いて定量した。LINC00028とmiR-204-5pの関係の予測はオンラインツールmiRcodeを用いて行い、両者の関係の検証はデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ、RNA免疫沈降（RIP）アッセイ、RNAプルダウンアッセイを用いて行った。緑内障組織およびTGFβ1処理HTFにおいてLINC00028の発現が上昇した。LINC00028のダウンレギュレーションはTGFβ1処理HTFの増殖、遊走、浸潤、EMT、線維化、オートファジーを阻害した。また、miR-204-5pはLINC00028の標的であり、その再導入はLINC00028のダウンレギュレーションと同様の役割を果たした。miR-204-5pの阻害は、TGFβ1処理HTFにおいてLINC00028ダウンレギュレーションの効果を逆転させた。LINC00028はmiR-204-5pを競合的に標的とすることで、増殖、遊走、浸潤、EMT、線維化、オートファジーを制御してHTFsの発生を誘導しており、緑内障濾過治療のための有望なバイオマーカーと考えられた。

Glaucoma is a leading cause of blindness worldwide with complex pathogenesis. The excessive proliferation and fibrosis of human tenon capsule fibroblasts (HTFs) trigger the scar formation after glaucoma filtration surgery. The purpose was to investigate the role of long intergenic non-protein coding RNA 28 (LINC00028) and mechanism in transforming growth factor β1 (TGFβ1)-treated HTFs. The detection of LINC00028 and miR-204-5p expression was conducted using quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Cell proliferation was assessed by cell counting kit-8 (CCK-8) assay. Cell migration and invasion were monitored by transwell assay. The expression of Epithelial-mesenchymal transition (EMT)-related markers, including E-cadherin, α-Smooth muscle actin (α-SMA), fibronectin and β-catenin, and autophagy-related markers, including Beclin 1 and light chain 3 (LC3-II and LC3-I) at the protein level was quantified using western blot. The prediction of the relationship between LINC00028 and miR-204-5p was performed by the online tool miRcode, and the verification of the relationship between them was conducted using dual-luciferase reporter assay, RNA immunoprecipitation (RIP) assay and RNA pull-down assay. The expression of LINC00028 was elevated in glaucoma tissues and TGFβ1-treated HTFs. LINC00028 downregulation blocked proliferation, migration, invasion, EMT, fibrosis and autophagy of TGFβ1-treated HTFs. MiR-204-5p was a target of LINC00028, and its reintroduction exerted a similar role of LINC00028 downregulation. The inhibition of miR-204-5p reversed the effects of LINC00028 downregulation in TGFβ1-treated HTFs. LINC00028 regulated proliferation, migration, invasion, EMT, fibrosis and autophagy to induce the development of HTFs by competitively targeting miR-204-5p, and LINC00028 was regarded as a promising biomarker for glaucoma filtration treatment.

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