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酵素単一分子の過渡状態のダイナミクスと機能の解明
Resolving dynamics and function of transient states in single enzyme molecules.
PMID: 32144241 PMCID: PMC7060211. DOI: 10.1038/s41467-020-14886-w.
抄録
我々は、ハイブリッド蛍光分光ツールキットを用いて、T4リゾチーム(T4L)の構造状態の動態と動的相互作用を解明することにより、T4リゾチームの作用をモニターする。特に、単一分子およびアンサンブルマルチパラメータ蛍光検出、EPR分光、突然変異誘発、FRETポジショニングおよびスクリーニング、その他の生化学的および生物物理学的ツールを組み合わせることにより、ns-msタイムスケールにわたって3つの短命なコンフォメーション状態を特徴づける。33のFRET由来の距離セットを用いて、利用可能なT4Lの構造をスクリーニングした結果、溶液中のT4Lは主に4μsの交換で既知の開状態と閉状態を採用していることが明らかになった。新たに発見されたマイナーな状態は、現在のところ500以上のT4Lの結晶構造で未公開であり、230μsでサンプリングされたものであるが、触媒反応における生成物放出ステップに積極的に関与している可能性がある。本研究で得られた蛍光分光ツールキットは、生物学的に非常に多く存在し、酵素反応に重要な過渡的な構造状態を同定することで、ダイナミックな構造生物学の開発を加速させるものと期待されています。
We use a hybrid fluorescence spectroscopic toolkit to monitor T4 Lysozyme (T4L) in action by unraveling the kinetic and dynamic interplay of the conformational states. In particular, by combining single-molecule and ensemble multiparameter fluorescence detection, EPR spectroscopy, mutagenesis, and FRET-positioning and screening, and other biochemical and biophysical tools, we characterize three short-lived conformational states over the ns-ms timescale. The use of 33 FRET-derived distance sets, to screen available T4L structures, reveal that T4L in solution mainly adopts the known open and closed states in exchange at 4 µs. A newly found minor state, undisclosed by, at present, more than 500 crystal structures of T4L and sampled at 230 µs, may be actively involved in the product release step in catalysis. The presented fluorescence spectroscopic toolkit will likely accelerate the development of dynamic structural biology by identifying transient conformational states that are highly abundant in biology and critical in enzymatic reactions.