オンラインHPLC-DPPHアッセイによる親水性相互作用クロマトグラフィーを用いたFloccularia luteovirensからの高極性フリーラジカル阻害剤の調製

Preparative isolation of highly polar free radical inhibitor from Floccularia luteovirens using hydrophilic interaction chromatography directed by on-line HPLC-DPPH assay.

• Jun Dang
• Chengbiao Chen
• Jianbin Ma
• YangZom Dawa
• Qi Wang
• Yanduo Tao
• Qilan Wang
• Tengfei Ji

抄録

野生の食用マクロ真菌であるFloccularia luteovirensは、治療効果のある新規なリード分子を同定するための貴重な情報源であることがわかった。しかし、効率的な精製方法がないために、Floccularia luteovirensの化学成分はほとんど報告されていない。本研究では、オンラインHPLC-DPPH法を用いた親水性相互作用クロマトグラフィーを開発し、Floccularia luteovirensのメタノール抽出物からフリーラジカル阻害剤を単離することに成功した。親水性相互作用クロマトグラフィーカラムを用いて、HPLC-DPPH法と組み合わせてラジカル消去剤のスクリーニングを行ったところ、中圧親水性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)の方が前処理の効率が高く、フリーラジカル消去剤を豊富に含む画分を良好な収率で得ることができた(新鮮なF. luteovirens 130.0gから5.9%の回収率)。活性の高い画分から、Click XION分取クロマトグラフィーを用いて、17.2%の回収率で目的化合物を単離した。単離された化合物はL-(+)-エルゴチオネインであり，クロマトグラフィーおよびHPLC-DPPHアッセイにより純度（95％以上）および抗酸化活性が確認された。この方法は、真菌抽出物からの高極性フリーラジカル阻害剤の認識と単離に非常に効率的であることが証明され、他のソースからの高極性化合物の精製にも適用可能である。

Wild edible macro fungi Floccularia luteovirens proved to be a valuable source for the identification of novel lead molecules with therapeutic potential. Nevertheless, the chemical constituents of Floccularia luteovirens are rarely reported due to absence of efficient purification methods. In this study, a hydrophilic interaction chromatography directed by on-line HPLC-DPPH assay has been developed and successfully applied for the isolation of free radical inhibitor from the methanolic extract of Floccularia luteovirens. Using a hydrophilic interaction chromatographic column coupled with the HPLC-DPPH assay for screening the potential radical scavengers, the mid-pressure hydrophilic interaction chromatography (HILIC) proved to be more efficient in the pretreatment stage, yielding the fraction rich in free radical scavengers in good yield (5.9% recovery from 130.0 g of fresh F. luteovirens). From highly potent fraction, the target compound was isolated using the Click XION preparative chromatography with 17.2% recovery. The isolated compound was L-(+)-ergothioneine, where the purity (>95%) and antioxidant activity of were confirmed by chromatography and HPLC-DPPH assay, while the structure of this compound was elucidated from HR ESI-MS and NMR data. This method proved to be very efficient for the recognition and isolation of highly polar free radical inhibitors from fungi extracts, and is also applicable for the purification of highly polar compounds from other sources.

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