2色および3色のSTORM解析により、マウス好中球の核内包膜上でのロイコトリエン合成複合体の高次集合体を明らかにした

Two- and three-color STORM analysis reveals higher-order assembly of leukotriene synthetic complexes on the nuclear envelope of murine neutrophils.

• Angela B Schmider
• Nicholas C Bauer
• Hongjae Sunwoo
• Matthew D Godin
• Giorgianna E Ellis
• Jeannie T Lee
• Peter A Nigrovic
• Roy J Soberman

抄録

ここ数年の間に、シグナルソームに代表される膜上の高次集合体が、多くの膜シグナル伝達プロセスを制御するためのパラダイムであることが明らかになってきました。我々は最近、2色直接確率的光学再構成顕微鏡（dSTORM）とクラスター検出とコロケーション解析を組み合わせたアルゴリズム（Clus-DoC）を用いて、5-リポキシゲナーゼ（5-LO）と5-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質（FLAP）が肥満細胞の核膜上で高次集合体を形成している様子を観察してきた。本研究では、5-LOとFLAPの高次集合体が細胞質ホスホリパーゼA（cPLA）を含み、マウス好中球におけるLTB産生と関連しているかどうかを調べた。蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いた2色および3色のdSTORMを用いて、5-LOの40分子（中央値）（IQR：23, 87）、およびFLAPモノマーの53分子（62, 156）を含む高次集合体を同定した。cPLAの98分子（18、154）は5-LOとクラスター化しており、cPLAの77分子（33、114）はFLAPと関連していた。これらの集合体は、ＬＴＢ形成と密接に関連していた。核エンベロープ上の高次集合体におけるcPLA、FLAP、および5-LOの活性化依存的な密接な関連付けは、アラキドン酸は、LT合成を開始するために5-LOにその転送を容易にする、FLAPに近接してcPLAによって生成されるモデルをサポートしています。

Over the last several years it has become clear that higher order assemblies on membranes, exemplified by signalosomes, are a paradigm for the regulation of many membrane signaling processes. We have recently combined two-color direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) with the (Clus-DoC) algorithm that combines cluster detection and colocalization analysis to observe the organization of 5-lipoxygenase (5-LO) and 5-lipoxygenase-activating protein (FLAP) into higher order assemblies on the nuclear envelope of mast cells; these assemblies were linked to leukotriene (LT) C production. In this study we investigated whether higher order assemblies of 5-LO and FLAP included cytosolic phospholipase A (cPLA) and were linked to LTB production in murine neutrophils. Using two- and three-color dSTORM supported by fluorescence lifetime imaging microscopy we identified higher order assemblies containing 40 molecules (median) (IQR: 23, 87) of 5-LO, and 53 molecules (62, 156) of FLAP monomer. 98 (18, 154) molecules of cPLA were clustered with 5-LO, and 77 (33, 114) molecules of cPLA were associated with FLAP. These assemblies were tightly linked to LTB formation. The activation-dependent close associations of cPLA, FLAP, and 5-LO in higher order assemblies on the nuclear envelope support a model in which arachidonic acid is generated by cPLA in apposition to FLAP, facilitating its transfer to 5-LO to initiate LT synthesis.

© 2020 Schmider et al.